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实时荧光定量 PCR 技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物学技术平台

实时荧光定量 PCR 技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物学技术平台 江燕琼. 提纲：

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实时荧光定量 PCR 技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物学技术平台

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Presentation Transcript

  1. 实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物学技术平台 江燕琼

  2. 提纲：􀂇 • 实时荧光定量PCR原理􀂇 数学原理 化学原理 • 实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量 • 定量PCR的实验要素 • 平台定量PCR仪器介绍

  3. 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。

  4. 与普通PCR的区别 • 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 • 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。

  5. 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 • 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。

  6. 定量PCR的数学原理

  7. 斜率与扩增效率

  8. 荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan

  9. 1、SYBR Green 法

  10. SYBR Green 熔解曲线分析

  11. SYBR Green法优缺点 • 优点: • 对DNA模板没有选择性 • 适用于任何DNA􀂉 • 使用方便--不必设计复杂探针􀂉 • 非常灵敏􀂉 • 便宜

  12. 2、TaqMan探针法

  13. TaqMan作用机理

  14. TaqMan法优缺点

  15. Real-time PCR 方法应用

  16. •绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 • •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究

  17. 绝对定量与相对定量的定义

  18. 绝对定量通过标准品定量 • 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： • •含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 • •含有和待测样品相同扩增片段的cDNA • •PCR的产物

  19. 绝对定量：从荧光到拷贝数

  20. 相对定量通过内标定量 • 内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 • 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 • 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量

  21. 相对定量：参照因子Calibrator

  22. 相对定量分析方法1 -ΔΔCt 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏 差在 5％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值： ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCT=表达量的比值

  23. 相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度

  24. 定量PCR的实验要素

  25. 样品 ●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL

  26. 标准品

  27. 标准品梯度稀释方法

  28. 复管测试 ●样品和标准品都要重复 ●重复次数须遵循统计学要求

  29. 平台PCR仪介绍 ABI 7500 fast 特征： 使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观 ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动） Rn= Normalization = Reporter / Referenc

  30. Rotor gene 6500HRM 特征： 36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔(特殊0.1ml管) 离心式检测 可以做HRM。

  31. MJ Opticon 2 特征： 可以使用8连排管或96孔板，软件操作简单

  32. 谢谢！

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