实验九环境样品中细菌总数的测定

实验九环境样品中细菌总数的测定 ------ 平板菌落计数法

微生物生长量的测定 （一）稀释平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。（二）血球计数板法（P53）这种方法的特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外测定结果是微生物个体的总数（活菌和死菌）（三）称干重（一般干重为湿重的10-20%）这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。（四）比浊法 (浊度计）

一、实验目的 1．学习环境样品（水样、泥样）采取方法和细菌总数的测定方法。 2．了解平板菌落计数的原则 1．学习环境样品（水样、泥样）采取方法和细菌总数的测定方法。 2．了解平板菌落计数的原则 3. 比较不同环境中细菌种类、数量的差异

二、基本原理 • 本实验应用平板菌落计数技术来测定环境样品中的细菌总数。 • 由于水/泥样中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差异很大，不可能找到一种培养基在同一条件下，使所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中总细菌总数仅是近似值。目前，一般是采用营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基---淡水、土壤中细菌，2216E---海洋细菌的生长繁殖，出现肉眼可见的菌落来计数。

计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。 • 待测样品不易分散成单细胞，平板上每个菌落有可能来自2个或多个细胞。因此，计数结果比实际细胞数低，CFU(菌落形成单位）绝对菌落数来表示样品中活菌含量的原因。 • 　　这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，37℃24-48h培养后所生长的菌落数。

三、材料与器皿 (—) 固体培养基 1、牛肉膏蛋白胨培养基（用于淡水、土壤样） 2．2216E培养基(用于海水、海泥样)

（二）材料： 移液器、灭菌水、无菌平皿、盛有4. 5 ml无菌水的试管、试管架和记号笔等。（在空试管中加入无菌水及待测样品混匀）

四、实验操作 1. 水样采集-----湖水和海水将无菌的带玻塞的小口瓶，瓶口向下浸入距水面10～15cm深的水层中，然后翻转过来，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流人瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。

2.细菌总数的测定 菌液逐级稀释过程示意图

(1)水样吸取及水样稀释 • 选择平均菌落数在50～200之间稀释度的平板为适宜。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数，作为该样的细菌总数进行报告。若细菌数多到无法计数时需要继续稀释，使其稀释培养后平板上的菌落数在30-300个之间。（在本实验中，预先了解环境样品中可能的细菌数量，设计稀释梯度；如未知环境样品，应该做多个试验梯度及3个以上平行梯度）

(2)吸取稀释后水样（0.2ml）加入平板 (3)于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的琼脂培养基(15～20mL) (4)置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。

（5）计数 (一)菌落计算原则 • 对那些看来相似，并且长得相当接近，但并不相触的菌落，只要它们之间的距离至少相当于最小菌落的直径，便应该—一予以计数。 • 对链状菌落．看来似乎是由于一团细菌在琼脂培养基和水样的混合中被崩解所致，应把这样的一条链当做一个菌落来计数，不可去数链上各个单—的菌链。 • 若同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半时，而另—半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下—步计算时用。

（二）计数方法 培养48h后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5（每次取样均是0.2ml）（1）计算相同稀释度的平均菌落数。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。如相差较大，表示试验不精确。

（2）选择平均菌落数在50～200之间稀释度的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数，作为该水样的细菌总数进行报告。（2）选择平均菌落数在50～200之间稀释度的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数，作为该水样的细菌总数进行报告。

（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。如比值小于2，应取两者的平均数；如比值大于2，则取其中较小的菌落总数进行报告。（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。如比值小于2，应取两者的平均数；如比值大于2，则取其中较小的菌落总数进行报告。（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数进行。

（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。

计算菌落总数方法举例

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

（7）菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水样的稀释倍数。（7）菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水样的稀释倍数。

注意事项： • 稀释操作时，要尽量减少样品稀释误差，而且每个稀释度的菌液应各用一支枪头。 • 充分混匀。震荡是多角度震荡，每个部位都振，混匀很重要的（有些细菌比较黏稠，要打散成单细胞） • 倒平板时要注意控制培养基的温度，一方面防止琼脂过热（手背皮肤有针刺感）和凝固（会影响后期的结果） • 为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀。 • 标准方法规定在样品制备的30min内进行倾注或涂步,以防止细菌的自溶。大多数的细菌20min一代，但是在处理样品中的微生物是受到应激的，生长力并不是很强（但是我们也不能排除这种可能）

实验报告 • 报告样品中细菌总数 • 分析实验结果（成功或失败，可能的问题） • 比较不同环境样品中细菌种类和数量的差异

实验九 环境样品中细菌总数的测定