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实验九 环境样品中细菌总数的测定

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sopoline-mendoza
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实验九 环境样品中细菌总数的测定

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Presentation Transcript

  1. 实验九 环境样品中细菌总数的测定 ------ 平板菌落计数法

  2. 微生物生长量的测定 (一)稀释平板菌落计数法 是一种最常用的活菌计数法。 (二)血球计数板法(P53) 这种方法的特点是测定简便、直接、快速,但测定的对象有一定的局限性,只适合于个体较大的微生物种类,如酵母菌、霉菌的孢子等;此外测定结果是微生物个体的总数(活菌和死菌) (三)称干重(一般干重为湿重的10-20%) 这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定,对于细菌来说,一般在实验室或生产实践中较少使用。 (四)比浊法 (浊度计)

  3. 一、实验目的 1.学习环境样品(水样、泥样)采取方法和细菌总数的测定方法。 2.了解平板菌落计数的原则 1.学习环境样品(水样、泥样)采取方法和 细菌总数的测定方法。 2.了解平板菌落计数的原则 3. 比较不同环境中细菌种类、数量的差异

  4. 二、基本原理 • 本实验应用平板菌落计数技术来测定环境样品中的细菌总数。 • 由于水/泥样中细菌种类繁多,它们对营养和其它生长条件的要求差异很大,不可能找到一种培养基在同一条件下,使所有的细菌均能生长繁殖,因此,以一定的培养基平板上生长出来的菌落,计算出来的水中 总细菌总数仅是近似值。目前,一般是采用营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基---淡水、土壤中细菌,2216E---海洋细菌的生长繁殖,出现肉眼可见的菌落来计数。

  5. 计数时,先将待测样品作一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含菌数。计数时,先将待测样品作一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含菌数。 • 待测样品不易分散成单细胞,平板上每个菌落有可能来自2个或多个细胞。因此,计数结果比实际细胞数低,CFU(菌落形成单位) 绝对菌落数来表示样品中活菌含量的原因。 •   这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定(如杀虫菌剂),生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁,而且测定值常受各种因素的影响。 本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数,这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中,37℃24-48h培养后所生长的菌落数。

  6. 三、材料与器皿 (—) 固体培养基 1、牛肉膏蛋白胨培养基(用于淡水、土壤样) 2.2216E培养基(用于海水、海泥样)

  7. (二)材料: 移液器、灭菌水、无菌平皿、盛有4. 5 ml无菌水的试管、试管架和记号笔等。(在空试管中加入无菌水及待测样品混匀)

  8. 四、实验操作 1. 水样采集-----湖水和海水 将无菌的带玻塞的小口瓶,瓶口向下浸入距水面10~15cm深的水层中,然后翻转过来,瓶口朝上,除去瓶塞,待水流人瓶中装满后,盖好瓶塞,取出后立即进行检测,或临时存于冰箱,但不能超过24h。

  9. 2.细菌总数的测定 菌液逐级稀释过程示意图

  10. (1)水样吸取及水样稀释 • 选择平均菌落数在50~200之间稀释度的平板为适宜。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,则以该平均菌落数乘以稀释倍数,作为该样的细菌总数进行报告。若细菌数多到无法计数时需要继续稀释,使其稀释培养后平板上的菌落数在30-300个之间。 (在本实验中,预先了解环境样品中可能的细菌数量,设计稀释梯度;如未知环境样品,应该做多个试验梯度及3个以上平行梯度)

  11. (2)吸取稀释后水样(0.2ml)加入平板 (3)于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中,倒入溶化后冷却至45℃左右的琼脂培养基(15~20mL) (4)置水平位置,迅速旋动混匀,待凝固后,倒置于37℃温室中培养。

  12. (5)计数 (一)菌落计算原则 • 对那些看来相似,并且长得相当接近,但并不相触的菌落,只要它们之间的距离至少相当于最小菌落的直径,便应该—一予以计数。 • 对链状菌落.看来似乎是由于一团细菌在琼脂培养基和水样的混合中被崩解所致,应把这样的一条链当做一个菌落来计数,不可去数链上各个单—的菌链。 • 若同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半时,而另—半中菌落分布又均匀,则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后,应算出同一稀释度的平均菌数,供下—步计算时用。

  13. (二)计数方法 培养48h后,取出培养皿,算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数,并按下列公式进行计算: 每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5(每次取样均是0.2ml) (1)计算相同稀释度的平均菌落数 。 同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。如相差较大,表示试验不精确。

  14. (2)选择平均菌落数在50~200之间稀释度的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,则以该平均菌落数乘以稀释倍数,作为该水样的细菌总数进行报告。(2)选择平均菌落数在50~200之间稀释度的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,则以该平均菌落数乘以稀释倍数,作为该水样的细菌总数进行报告。

  15. (3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30~300之间,则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。如比值小于2,应取两者的平均数;如比值大于2,则取其中较小的菌落总数进行报告。(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30~300之间,则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。如比值小于2,应取两者的平均数;如比值大于2,则取其中较小的菌落总数进行报告。 (4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数进行。

  16. (5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。 (6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间,则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。

  17. 计算菌落总数方法举例

  18. 平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很重要,一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很重要,一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

  19. (7)菌落计数的报告,菌落在100以内时按实有数报告;大于100时,采用二位有效数字;在二位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。在所需报告的菌落数多至无法计算时,应注明水样的稀释倍数。(7)菌落计数的报告,菌落在100以内时按实有数报告;大于100时,采用二位有效数字;在二位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。在所需报告的菌落数多至无法计算时,应注明水样的稀释倍数。

  20. 注意事项: • 稀释操作时,要尽量减少样品稀释误差,而且每个稀释度的菌液应各用一支枪头。 • 充分混匀。震荡是多角度震荡,每个部位都振,混匀很重要的 (有些细菌比较黏稠,要打散成单细胞) • 倒平板时要注意控制培养基的温度,一方面防止琼脂过热(手背皮肤有针刺感)和凝固(会影响后期的结果) • 为使菌落能在平板上均匀分布,样品液加入平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀。 • 标准方法规定在样品制备的30min内进行倾注或涂步,以防止细菌的自溶。大多数的细菌20min一代,但是在处理样品中的微生物是受到应激的,生长力并不是很强 (但是我们也不能排除这种可能)

  21. 实验报告 • 报告样品中细菌总数 • 分析实验结果(成功或失败,可能的问题) • 比较不同环境样品中细菌种类和数量的差异