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化学化工学院. School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University. 2014/10/14. 核酸酶酶解 - 高效 液相色谱法分析 DNA 组成. 国家级化学实验教学示范中心. LOADING. 综合化学实验. 以能力培养为核心 ，知识传授、能力培养、素质提高全面协调发展。. 全面科学教育要求教学既传授科学知识和技术，更训练科学方法和思维，还培养科学精神和品德。. / 实验目的 /. 进一步掌握高效液相色谱实际应用. 学习酶解的实际操作.

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Presentation Transcript

  1. 化学化工学院 School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University 2014/10/14 核酸酶酶解-高效 液相色谱法分析DNA组成 国家级化学实验教学示范中心 LOADING 综合化学实验 以能力培养为核心 ，知识传授、能力培养、素质提高全面协调发展。 全面科学教育要求教学既传授科学知识和技术，更训练科学方法和思维，还培养科学精神和品德。

  2. /实验目的/ • 进一步掌握高效液相色谱实际应用 • 学习酶解的实际操作 • 尝试应用分析化学方法和生物化学知识解决实际问题

  3. /实验原理/ • 核酸酶P1 水解单链DNA或RNA的3’-5’磷酸二酯键 将其定量降解为4种核苷酸

  4. /实验原理/ • 碱基配对原理 C通过氢键与G配对 A通过氢键与T配对 C与G浓度相等 A与T浓度相等

  5. /实验原理/ • DNA的熔点(熔解温度 ) Tm：加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度 (G+C)%与Tm间存在一个经验关系： (G+C)% = (Tm-69.3)2.44

  6. /实验原理/ • HPLC • 根据被测组分在流动相和固定相间相互作用强度的 不同将被测组分分离，与固定相相互作用弱的组分 先流出色谱柱，与固定相相互作用强的组分后流出 色谱柱。核苷酸的混合物可以采用离子交换色谱或 反相色谱实现基线分离。

  7. /实验原理/ • 以dGMP为内标，根据标样的峰面积利用归一化法计算dCMP，dTMP，dAMP的响应因子 根据酶解后的DNA样品的峰面积和相应的响应因子 计算出dCMP，dTMP，dAMP的浓度，并计算C+G的分数

  8. /实验步骤/ 现有一未知DNA样品，应用基本的生物化学知识和本实验 提供的试验条件解决, 自行设计实验步骤以回答下列问题： • 该样品是单链DNA还是双链DNA？证据是什么？ • 若该样品中含有两条单链DNA，如何证实这两条 单链是由原来互补的DNA双链变性而来还是两条 不互补的单链DNA？ • 测定该DNA样品的(G+C)%值，求算该DNA的 溶解温度Tm。

  9. /讨论与思考题/ • 计算相对浓度[C]/[G]、[T]/[G]和[A]/[G]。[C]/[G]的 理论值应为多少？[T]/[G]和[A]/[G]间的理论关系是 什么？ • 对于相同的DNA，利用单链和双链测得的(G+C)含 量相同吗？为什么？ • 在本实验中你是否观察到一些同你的预期不符合的 实验结果或现象？若有，如何解释？

  10. /参考资料/ • WIETSTOCK S M.DNA composition analysis by nuclease digestion and HPLC[J]. J. Chem. Edu., 1995, 72: 950-952. • KATAYAMA-FUJIMURA Y, KOMATSU Y, KUR- AISHI H, et al. Estimation of DNA base compos- ition by high performance liquid chromatography of its nuclease P1 hydrolysate[J]. Agric. Biol. Chem., 1984, 48: 3169-3172. • 王镜岩等编. 生物化学[M].3版.北京：高等教育出版社， 2002: 第12-15章.

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