冰冻切片

1. 冰冻切片

2. 冰冻切片简介 • 冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度, 然后进行切片的一种方法。因其制作过程较石蜡切片相对简便、快捷, 都应用于手术中快速病理诊断。我科于1975 年开展术中冰冻切片检查, 1995 年采用快速恒冷式切片机(德国LE2ICACM1850) , 作冰冻切片1100 余例, 其中包括乳腺、肺、喉、甲状腺、淋巴结、消化道、泌尿道、卵巢、子宫、皮肤等组织。结果显示, 切片顺利, • 制作效果满意, 为病理诊断提供了可靠的依据。既免除了患者多次手术带来的巨大痛苦, 又节约了患者的住院费用, 深受广大临床医生及患者的欢迎及好评。

3. 冷冻切片的种类 • 冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。

4. 冰冻切片的制作 • 取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 • 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 • 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 • 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 • 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 • 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。

5. 冰冻切片的快速染色法 • 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

6. 方法： • 切片固定30秒－1分钟。 • 水洗。 • 染苏木素3－5分钟。 • 分化。 • 于碱水中返蓝20秒。 • 伊红染色10－20秒。 • 脱水，透明，中性树胶封固。

7. 操作过程中常见问题与处理

8. 标本固定应充分 • 标本经固定或不固定均可，但经过固定的组织切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰，而未固定的组织冰晶多，细胞挤压变形大，甚至会影响观察结果。因此，除特别需要外，一般较多采用组织固定后再行切片。固定方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定。灌注法适用于动物实验研究。用于组织固定的固定剂种类很多，包括醛类、非醛类、丙酮及醇类等，其中以中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用2’，- 3组织固定时，一方面固定液要有足够的量，另一方面还要保持一定时间，一般在快速灌注固定取材后，多用相同的固定剂再固定! % " ，以使组织充分固定，这对保持切片的完整性尤为重要。

9. 减少冰晶的形成 • 未经固定的组织切片时冰晶较多，这是公认的事实，即使固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，为防止冰晶的形成，常可采取如下方法： 1.速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降温。2.利用高渗溶液吸收组织分子：将组织置于20% ——30%的蔗糖溶液中， 置4摄氏度冰箱足够时间，观察组织快，待其沉底后，取出切片。这样即可大大减少冰晶的形成。

10. 保持切片的完整性 • 破碎的组织切片必然丢失实验信息，切片的完整性对研究结果的分析无疑十分重要。切片破碎不全、有缺损的常见原因有： 1组织固定不完全； 2温度设置不当。组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎。组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎；3组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多；4 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整；5操作手法不当，如速度不适宜，切片也可能不完整。遇到上述情况，应有针对性的采取相应的措施。如注意组织固定充分、尽量减少冰晶的形成，保持刀片的清洁与锋利，冷冻温度要适宜，不同的组织应设置不同的温度，如较大组织块或含有较多脂肪的组织应设置温度相对较低 ，冷冻时间稍长些。而脑、脊髓等温度设置相对高些有作者采用“边冻边切”法制作切片，同样也取得较好的效果。若组织带有不必要的皮肤或包膜，应尽量去除干净；如必须保留皮肤或包膜，应注意采取相应的切片技术，如最好将皮肤或包膜的平面与刀面垂直。此外，在切片时，应注意速度均匀。当然，要做好这些，必须有一定的实践经验。

11. 防止切片卷缩 • 切片卷缩是指切片不进入防卷板与刀台之间或当掀起防卷板时切片卷起。常见原因有：切片刀钝或粘有组织碎屑、防卷板位置不正确或防卷板较脏、静电或者气流作用、防卷板温度高、室温高等。可采取以下对策： 1保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤，与切片接触面应为磨面，其边缘应于切片刀边缘平行。2采取相应措施去除静电，操作者应尽可能戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板。3切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室盖，降低防卷板温度。4 开放式冰冻切片机，切片时暴露空气中，温度不易控制，在高温季节，切片非常容易卷缩，切片技术难度大，采用冻刀加冻台法效果好些。

12. 贴片中常见问题及处理 • 载玻片粘不上切片。此情况多见于准备片染的载玻片温度过低，只要使载玻片与切片间有一定温度差，切片即可贴到载玻片上，一般将载玻片置于常温即可。’, ( 贴片时切片易碎。排除固定不充分等因素外，漂片处理贴片时应注意动作轻、稳、准。根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适的毛笔，将笔尖伸入片下水中，往上轻轻将切片挑起，并展开。

13. 封片过程中常见问题分析及处理 • 封入气泡注意通过挤压盖玻片将气泡排除。 • 滴蛋白甘油过多封片时滴过多的蛋白甘油，就使整个片子显得不干净，影响观察，因此，应注意适量，万一过量，可先用滤纸沾干，片子晾干后，可用绸布蘸二甲苯擦除。

14. 优点： 简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 缺点： 不容易做连续切片。 切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 不容易制作较薄的切片。 组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。 冰冻切片的优缺点

15. 主要应用于： • 用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。 • 用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。 • 用于临床手术的快速病理诊断。

16. 冰冻切片与石蜡切片的比较 • 近年来随冰冻切片技术的发展, 冰冻切片质量明显提高, 但与石蜡切片相比仍有一定的差距。石蜡切片由于组织受福尔马林的作用, 固定迅速而完全, 且组织经脱水透明及浸蜡多道步骤后, 使游离在组织中一些小分子物质被洗脱, 组织再经过充分的脱脂后非常容易与染色剂亲合。故石蜡切片中细胞界限明确。染色分明, 背景清晰。 • 　　由于冰冻切片的制作原则与石蜡切片不同, 制作一张质量高的冰冻切片不仅要做到组织速冻完全, 防止冰晶产生, 并需注意切片染色的各个操作环节, 而且冰冻切片固定完全与否也会对切片质量产生很大的影响。实验组冰冻切片先经HS 固定液, 使其具有与石蜡切片相类似的环境, 组织固定彻底, 经流水冲洗, 将多余的固定液和切片中溶于固定液的小分子物质洗去, 这就消除了切片被遮盖以至染色模糊的缺点。切片再经第二液Clarke 固定液的再固定及酒精脱脂作用,使染色剂与组织亲合性增强染色鲜明。还消除了因细胞核固定不良, 所致染色对比不分明的缺陷。对照组切片未经HS 固定液及流水冲洗而直接入Clarke 固定液, 固定效果不如双重固定法, 与实验组切片相比较则显染色不甚清晰, 背景模糊。　　通过使用两种不同固定方法结果的比较, 我们认为双重固定液法在冰冻切片中应用良好, 明显优于Clarke 氏单液固定法, 值得推广应用。

17. 合成胶水的影响 • 临床病理工作中经常遇到一些微小组织做冰冻切片,我们体会到,异体脏器组织包埋法中的异体脏器组织存留在载玻片上,不易擦除干净,留有背景对切片外观有影响,时有微小组织与异体脏器组织间包埋时易产生间隙,给切片带来不便。石蜡包埋托法往往因包埋托有一定厚度影响冷冻时间,而且仍然需要OCT 包埋剂。合成胶水水溶性好,与组织结合紧密,二者形成完整整体,而且冷冻后硬度相当,利于切片,切片上的胶膜水洗后完全溶解,不会造成污染和遗留背景色。合成胶水用量少,冷冻时间短,组织不会形成冰晶 ,因此镜检时细胞形态完整,染色清晰。合成胶水来源简便、经济、冷冻快速。实为一种实用的替代方法。