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米曲霉固态发酵产生蛋白酶

米曲霉固态发酵产生蛋白酶. 微生物与免疫教研室. 实验目的要求. 掌握固态培养微生物原理和技术 掌握蛋白酶活性的分析方法. 实验原理. 固态发酵： 广义：指是指在没有或者几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。 狭义：利用底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固体支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程。. 1 、固态培养方法：散曲法和块曲法. 2 、部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法. 3 、黄酒用曲及白酒用曲一般用块曲法. 固态发酵的优点. 培养基简单而且来源广泛 投资少，能耗低，技术简单

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米曲霉固态发酵产生蛋白酶

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Presentation Transcript

  1. 米曲霉固态发酵产生蛋白酶 微生物与免疫教研室

  2. 实验目的要求 • 掌握固态培养微生物原理和技术 • 掌握蛋白酶活性的分析方法

  3. 实验原理 固态发酵： 广义：指是指在没有或者几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。 狭义：利用底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固体支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程。

  4. 1、固态培养方法：散曲法和块曲法 2、部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法 3、黄酒用曲及白酒用曲一般用块曲法

  5. 固态发酵的优点 • 培养基简单而且来源广泛 • 投资少，能耗低，技术简单 • 产物的产率高 • 基质含水量低，可大大减少反应器的体积，不需要废水的处理，环境污染少，后处理加工方便。

  6. 实验材料 • 菌种：米曲霉（Aspergillus oryzae） • 培养基： ⑴试管斜面培养基 ①豆饼浸出汁 ②马铃薯培养接（PDA）

  7. 米曲霉 • 属于曲霉菌，具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性，中性，碱性蛋白酶，其稳定性高，能耐较高的温度，广泛应用于食品、医药和饲料等工业中。菌落初为白色、黄色、既而变成黄褐色及淡绿褐色，反面无光。

  8. ⑵三角瓶培养基 A、麸皮培养基：麸皮30g；酵母粉3.3g；乳糖3.3g；水30ml B、豆粕培养基：豆粕粉10g；麸皮90g；水110ml，装料厚度1cm左右，121℃30min灭菌。

  9. （3）仪器、设备和材料 • 恒温培养箱 • 水浴锅 • 分光光度计 • 试管 • 250三角锥形瓶 • 0.2mol/L磷酸缓冲液 • 酪氨酸

  10. 实验流程 ①菌种的纯化 ②制成斜面 ③将斜面菌种接种入250ml三角瓶培养成种曲 ④种曲扩大培养（500ml三角瓶） ⑤米曲霉培养物，水溶液萃取，得粗酶制剂 ⑥蛋白酶活力的测定

  11. 实验方法—米曲霉的发酵 1、培养基的配置：按麸皮培养基配置方法配制培养基装于250ml锥形瓶中,115 ℃ 灭菌20min。 2、无菌条件下用NS洗涤斜面菌种上的培养物，并接种于三角培养瓶中。 3、将三角瓶置于28-30 ℃ ，培养20h，待菌丝布满培养基后，摇瓶，使培养基松散。每隔8h检查一次，并摇瓶。培养时间为48-70h。

  12. 实验方法—蛋白酶活力的测定 1、样品处理： 称取充分研细的成曲5g，加入100ml蒸馏水，40℃水浴间断搅拌60分钟，使其充分溶解。然后用纱布过滤，吸取滤液1ml，用适当的缓冲液稀释（0.1mol/LPH7.2PBS缓冲液）成一定的倍数。另外再称取5g成曲先烘干，算出样品水份百分含量。

  13. 2、标准曲线的制备 A、取6根试管，编号，按下表加入试剂，制备一定浓度的酪氨酸标准溶液（单位：ml）

  14. B、另取6支试管，加入不同浓度的上述酪氨酸溶液1ml，各加入0.4mol/L碳酸钠5ml，再各加入已稀释的福林试剂1ml，摇匀，置40℃恒温水浴中显示20min。B、另取6支试管，加入不同浓度的上述酪氨酸溶液1ml，各加入0.4mol/L碳酸钠5ml，再各加入已稀释的福林试剂1ml，摇匀，置40℃恒温水浴中显示20min。 C、用分光光度计在波长660nm处测定OD值，一般平行测三次，取平均值。 D、以吸光度为纵坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

  15. 3、样品蛋白酶活力的测定

  16. 4、空白实验

  17. A、上述样品测定管和空白实验管，均以蒸馏水为空白。A、上述样品测定管和空白实验管，均以蒸馏水为空白。 测得样品净OD=样品的平均OD-空白的平均OD B、计算：在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个酶活力单位。 C、样品蛋白酶活力单位（干基） =A/10×4×N×1/1-w

  18. A：由样品测得OD值，查标准曲线得到相应的酪氨酸微克数。A：由样品测得OD值，查标准曲线得到相应的酪氨酸微克数。 4：4ml反应液取出1ml测定（即4倍） N：酶液稀释倍数 10：反应十分钟 W：样品水分百分含量

  19. 实验结果与讨论 • 绘制标准曲线，计算米曲霉培养过程中产生的蛋白酶活力单位。 • 分析实验结果

  20. 实验所需配制的试剂 1、0.2mol/LPBS缓冲液： B液：Na2HPO4·12H2O:7.16g定容至100ml A液：NaH2PO4·2H2O:1.56g定容至50ml 取A液28ml+ B液72ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成O.1mol/LPH7.2PBS缓冲液。

  21. 实验所需配制的试剂 2、0.4mol/L三氯乙酸： 三氯乙酸3.27g；水50ml 3、0.4mol/LNaCO3： NaCO3 2.12g；水50ml 4、2%酪蛋白溶液：

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