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诊断酶学

诊断酶学. 诊断酶学的发展简史. 1908年测尿 AMY 活力 —— 诊断急性胰腺炎； 30年代 ALP 用于诊断骨骼疾病和肝脏疾病； 50年代用分光光度法建立 连续监测酶活性 方法使诊断酶学有了飞跃发展； 70年代初，逐步将注意力集中到同工酶测定上； 随着免疫学和技术方法的进展，用抗原抗体反应有可能直接测定微量的酶蛋白。. 第一节 酶的概念与特征. 一、酶的组成、结构和功能. （一）酶的本质与特性 由活细胞产生的可在细胞内外起催化作用的蛋白质。 （生物催化剂 ）

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  1. 诊断酶学

  2. 诊断酶学的发展简史 • 1908年测尿AMY活力——诊断急性胰腺炎； • 30年代ALP用于诊断骨骼疾病和肝脏疾病； • 50年代用分光光度法建立连续监测酶活性方法使诊断酶学有了飞跃发展； • 70年代初，逐步将注意力集中到同工酶测定上； • 随着免疫学和技术方法的进展，用抗原抗体反应有可能直接测定微量的酶蛋白。

  3. 第一节 酶的概念与特征

  4. 一、酶的组成、结构和功能 （一）酶的本质与特性 由活细胞产生的可在细胞内外起催化作用的蛋白质。 （生物催化剂） Enzymes are proteins that have catalytic properties owing to their powers of specific activation of their substrates.

  5. 酶催化特点 • 高度的特异性 • 高催化效率 • 催化作用的可调节性

  6. 体外：浓硫酸，煮沸，20h以上 蛋白质 氨基酸 体内：pH7.4，37℃，1～2h

  7. （二）酶的结构与功能 单纯酶 结合酶酶蛋白（apoenzyme） 辅因子（cofactor）辅酶（coenzyme） 辅基（prosthetic group）

  8. 辅酶 （coenzyme）的概念 • 非蛋白质部分------酶蛋白 • 非共价键 • 透析、超滤能分离 • 辅基(prostheticgroup)的概念 • 非蛋白质部分------酶蛋白 • 共价键 • 透析、超滤不能分离

  9. Binding of a substrate to an enzyme at the active site. The enzyme chymotrypsin is shown, bound to a substrate (in blue). Some key active-site amino acids are shown in red.

  10. 二、酶的催化作用机制 （一）活化能 使作用物由一般状态转化为活化状态所需的能量称为活化能（activation energy）。 （二）酶降低活化能的作用机制 酶通过与底物形成一种或多种中间复合物来降低反应的活化能.

  11. Lock-and key model was developed by Emil Fischer (Fischer projections) in 1895.

  12. Induced-fit hypothesiswas proposed in 1959 by Daniel Koshland.

  13. 三、酶的命名、分类与编号 （一）酶的命名 1.习惯命名法 根据酶所催化的底物、反应的性质以及酶的来源等进行命名。例如：乳酸脱氢酶 2.系统命名法 即EC命名法，系统名称标明酶的底物与反应性质，底物名称之间以“：”分隔开。例如： L乳酸：NAD+氧化还原酶

  14. （二）酶的分类与编号 1.氧化还原酶（oxido-reductases) 2.转移酶(transferases) 3.水解酶(hydrolases) 4.裂合酶或裂解酶(lyases) 5.异构酶(isomerases) 6.合成酶或连接酶(synthetases or ligases)

  15. 4个数字分类酶编号 E、C、2，7，1，1 国际酶学委员会 类 亚类 亚亚类 亚亚类中 的排号

  16. 第二节 血清酶

  17. 一、血清酶的来源 （一）血浆特异酶：作为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用的酶类。如凝血酶原、LCAT等 • 有明确的生理功能； • 含量高于其他组织。

  18. （二）非血浆特异酶： • 在血中不起任何生理作用； • 浓度明显低于组织和细胞中含量。 1. 外分泌酶：血清中来源于外分泌腺的酶。 2.细胞酶：存在于机体各种组织细胞中进行物质代谢的酶类。如转氨酶、LD等

  19. 二、血清酶的去路 1.血清酶的半寿期 酶失活至原来活性一半时所需时间称为酶的半寿期（T1/2）。一般以血中酶的半寿期(half life)代表酶从血中清除快慢。 2.血清酶的失活和排泄 主要在血管内失活或分解。

  20. 三、血清酶变化的病理机制

  21. （一）酶合成异常 对于血浆特异酶，酶合成下降是引起血中酶变化的重要因素。 1. 合成减少：肝功能损伤 2. 合成增多：恶性肿瘤

  22. （二）酶释放增加 酶从损伤细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机理。 主要原因： 缺氧 能量供应缺乏 缺血、炎症、坏死、肿瘤

  23. 细胞内外酶浓度的差异 • 酶蛋白分子量的大小 • 酶的组织分布 • 酶在细胞内定位与存在形式

  24. （三）酶排出异常 • 肾功能减退时，血清AMY活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留所致。 • 胆道梗阻时，血清ALP升高的原因是梗阻区ALP合成加强，ALP排泄受阻而逆流入血。

  25. 四、血清酶的生理差异 • 性别 • 年龄 • 进食 • 运动 • 妊娠与分娩 • 其他

  26. 第四节、酶活性浓度的测定技术 一、酶活性浓度的测定 • 固定时间法 • 连续监测法 • 平衡法

  27. 1、固定时间法（两点法） 测定反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。 特点：需加终止剂； 应做预试验确定线性时间； 比色计或分光光度计无需保温装置。

  28. 2、连续监测法（动力学法或速率法） 连续测定（每15s-20min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法。 特点：结果准确； 无需终止反应； 仪器必须有保温装置； 产物或底物应是可直接测定的化合物。

  29. 3、平衡法（终点法） 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法。 特点：无需终止反应； 反应时间长，影响因素多； 适合零级反应期很短的酶促反应。

  30. 酶单位：反映在某一特定条件下使酶促反应 达到某一速度所需要的酶量。 • 惯用单位 • 国际单位（IU）：每分钟能催化1微摩尔 底物的酶量为1个国际单位。 • Katal单位：在确定的最适反应条件下每秒钟催化一个摩尔底物变化所需要的酶量。 • 1 Katal=60×106IU

  31. 二、标本的采集、处理与贮存 1. 避免体外溶血 2. 一般采用血清标本 3. 酶蛋白不稳定，易失活

  32. 第五节 酶的免疫化学测定

  33. 免疫化学测定的优缺点

  34. 第六节 同工酶和亚型测定

  35. 同工酶(isoenzyme)的分析可分为两步： 1. 精确地分离出各同工酶组分； 2. 测定酶的总活性和各同工酶组分的活性。

  36. 电泳法 （—） （+） 例如，LDH同工酶 LDH2、LDH3、LDH4、LDH5都比LDH1有较多的碱性氨基酸，在pH8.6的巴比妥缓冲液中LDH1带有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。

  37. 二、层析法 常用吸附柱层析、离子交换柱层析、凝胶过滤和亲和层析等。

  38. 三、免疫化学法 • 同工酶的一级结构不同，免疫化学性质也不同。 • 抗原决定簇不同的同工酶可用特异的免疫反应来识别。

  39. 四、动力学分析法 测定动力学参数是同工酶研究不可缺少的步骤，并且有些动力学分析法因其简便易行而用于临床实验室。

  40. 广泛利用酶诊断的原因 1.酶活力的变化早于临床体征或其他诊断指标； 2.测定酶活力的方法灵敏度、准确性较好。

  41. 诊断酶学的作用： 各种疾病的诊断、预后和随访观察

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