Genética Geral II

1. Genética Geral II Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza Depto de Genética – UFPR lehtonen@ufpr.br www.ufpr.br/~lehtonen

2. PCRReação em Cadeia da Polimerase • Inventada em 1983 por Kary Mullis • é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas Aplicações: • seqüenciamento de genes • diagnóstico de doenças hereditárias • testes de paternidade e na medicina forense • diagnóstico de doenças infecciosas

3. PCR Reação de PCR: • DNA • dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) • iniciadores (também chamados de primers) • DNA polimerase • solução tampão

4. PCR • Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos

5. Desnaturação • Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. • As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos.

6. Hibridação • A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns segundos. • Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde

7. Extensão • Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos. • A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores

8. PCR • animação

9. PCR – desenho dos iniciadores • Comprimento: em torno de 20 bases • GC: ideal em torno de 50% • Software para desenhar iniciadores: • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

10. PCR – desenho dos iniciadores

11. PCR-RFLP • Enzima de restrição: • mutação cria sítio de restrição • mutação elimina sítio de restrição • Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho • Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese

12. PCR-RFLP

13. PCR-RFLP • ALA • 539 540 541 545 546 • Seqüência normal....5'..GAA GCA GAA TGG.....GCA GG...3' • Iniciador (3') GT CGT ACC.....CGT CC • Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG..............3' •  • Fnu4HI ou BsoFI •  • ____________85 pb__________'________21 pb_________

14. PCR-RFLP 85pb 106pb KK UU UK

15. PCR-RFLP • Vantagem: rapidez • Desvantagem: algumas enzimas tem digestão parcial

16. PCR-SSCA (ou SSCP)Análise de Conformação de Fita Simples • Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). • DNA é amplificado por PCR • Depois é desnaturado por calor • Gel de poliacrilamida não desnaturante • As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e correm em posições diferentes no gel. • Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).

17. PCR-SSCA • Padronização da técnica  vários fatores • Relação bisacrilamida x acrilamida • Concentração de acrilamida • Tampão do gel  pH • Tempo de corrida • Temperatura de polimerização • Temperatura da corrida

18. PCR-SSCA

19. PCR-SSCA

20. Seqüenciamento didesoxi • Método de Sanger • Síntese de DNA na presença de nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3’-hidroxila. • Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese

21. Seqüenciamento • animação

24. PCR em tempo real • É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR • A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR. • Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial • Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese.

25. PCR em tempo real

26. PCR em tempo real • SYBRGreen • é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador. • Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado • Um aumento da fluorescência é observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contínuo da reação

27. PCR em tempo real SYBRGreen

28. PCR em tempo real • Taqman

29. PCR em tempo real

30. PCR em tempo real Aplicações • Quantificação • Detecção de carga viral • Determinação do número de cópias de um gene • Análise da expressão gênica

31. PCR em tempo real • Exemplo de aplicação: • Investigação de amplificação ou deleção dos genes BCHE e ACHE em tecido mamário tumoral com relação ao tecido normal.

32. PCR em tempo real Quantificação relativa TumorCHE / Tumor18S Q = ─────────────────────── SangueCHE / Sangue18S

33. PCR em tempo real Gene BCHE

34. Genotipagem com Taqman

35. Homozigoto para o alelo marcado com FAM

36. Heterozigoto

37. Homozigoto para o alelo marcado com VIC

38. Genotipagem

39. FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs2863381 Fonte: Alves, 2009

40. FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495 Fonte: Alves, 2009