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-抗胰蛋白酶的分离纯化

-抗胰蛋白酶的分离纯化. -抗胰蛋白酶. 来源 ： 主要由肝细胞合成，大量存在于血液 生理作用 ： 主要用于因遗传性 -AT缺乏引起的肺气肿患者 的终身替补治疗和肺部炎症性疾病的防治。. 分离纯化步骤. 1. 硫酸铵分级沉淀 2. DEAE- cellulose 离子交换层析 3. ConA-sepharose 4B亲和层析 4. SDS-PAGE凝胶电泳. 硫酸铵分级沉淀. 原理： 盐析时溶液中的离子强度不同时，不同蛋白质的溶解度不同. 硫酸铵分级沉淀.

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-抗胰蛋白酶的分离纯化

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Presentation Transcript

  1. -抗胰蛋白酶的分离纯化

  2. -抗胰蛋白酶 来源： 主要由肝细胞合成，大量存在于血液 生理作用： 主要用于因遗传性 -AT缺乏引起的肺气肿患者 的终身替补治疗和肺部炎症性疾病的防治。

  3. 分离纯化步骤 1.硫酸铵分级沉淀 2.DEAE-cellulose离子交换层析 3.ConA-sepharose 4B亲和层析 4.SDS-PAGE凝胶电泳

  4. 硫酸铵分级沉淀 原理： 盐析时溶液中的离子强度不同时，不同蛋白质的溶解度不同

  5. 硫酸铵分级沉淀 1.取猪血浆50ml加人等休积的饱和硫酸铁溶液混匀静置后于4℃、5000r/min,离心20min，取上清液加入硫酸铁达 75%饱和度 2.同样离心得沉淀,将沉淀溶解于pH6.4 0.05mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）中,透析后用聚乙二醇浓缩

  6. DEAE-cellulose离子交换层析 • DEAE-cellulose带负电 • -抗胰蛋白酶带正电

  7. DEAE-cellulose离子交换层析 柱床为2cm*35cm，用于pH6.4,0.05mol/L PBS平衡后上样,再用平衡液洗脱 ,待A280nm<0.1时换用pH6.4,0.12mol/L PBS洗脱，收集相应活力部分,用pH7.6，0.05mol/L PBS透析后，用聚乙二醇浓缩

  8. ConA-sepharose 4B亲和层析 ConA-sepharose 4B与 -抗胰蛋白酶有特异的亲和力

  9. ConA-sepharose 4B亲和层析 柱床2*25cm 用pH7.6，0.05mol/L PBS 平衡,上样后用平衡液洗脱, 当A280nm<0.05时换用含0.2mol/L a-甲基-D-葡萄糖酐的平衡液洗脱,收集活力部分,再用pH7.6，0.05mol/L PBS透析后，聚乙二醇浓缩。

  10. SDS-PAGE凝胶过滤 以聚丙烯酰胺凝胶为分子筛，过滤后然后洗脱即可的到目的产物 -抗胰蛋白酶

  11. SDS-PAGE凝胶过滤 柱床为1.5*50cm，用pH7.6，0.05mol/L PBS平衡，上样后用平衡液洗脱，收集。

  12. -抗胰蛋白酶分离纯化依据概括 1.物理特性： 分子大小，带电情况，溶解度 2.生化特性： 特异性亲和作用

  13. 谢谢！

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