通性 CAM 植物アイスプラントの プラスチド包膜リン酸輸送体の機能解析

1. 通性CAM植物アイスプラントのプラスチド包膜リン酸輸送体の機能解析通性CAM植物アイスプラントのプラスチド包膜リン酸輸送体の機能解析 理工学研究科分子生物学専攻 指導教官：大西　純一 野明　千雪

2. 4種類のプラスチド型リン酸輸送体 Cytosol CO2 Plastid ショ糖 カルビン回路 TPT トリオース リン酸 トリオース リン酸 ペントース リン酸 無機リン酸 無機リン酸　 解糖系 PPT ホスホエノール ピルビン酸 エリトロース ４-リン酸 ホスホエノール ピルビン酸 脂肪酸合成 芳香族アミノ酸 合成 XPT キシルロース ５-リン酸 キシルロース ５-リン酸 酸化的 ペントース リン酸経路 トリオース リン酸 トリオース リン酸 GPT グルコース ６-リン酸 グルコース ６-リン酸 NADH デンプン ショ糖

3. 高等植物のプラスチド型リン酸輸送体ファミリーの基質特異性高等植物のプラスチド型リン酸輸送体ファミリーの基質特異性

4. アイスプラントのプラスチド型リン酸cDNAとCAM化に伴う発現量変化アイスプラントのプラスチド型リン酸cDNAとCAM化に伴う発現量変化

5. 組替えタンパク質の作成 4種類のアイスプラントリン酸輸送体（McPT）のクローニング McPTのcDNA断片をPCR法で増幅し酵母発現用vectorpYES2に組込み、酵母細胞INVSc1を形質転換 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　→　TPT1・GPT1・GPT2　　○　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　PPT1× 3種類の形質転換体で目的タンパク質の誘導発現 形質転換体の細胞を破砕して細胞粗抽出液を調製

6. liposome再構成 核 発現ベクター タンパク質誘導発現 脂質 輸送体の基質 sonication 酵母質転換体 細胞を破砕して 粗膜画分抽出 Freeze-thaw法 Liposome内に交換基質を封入 （内部基質） 目的タンパク質 目的タンパクを人工膜に組込む

7. 取込み活性測定方法 32P 32P 32P 32P 25℃ インキュベーション 32P 一定時間経過後 阻害剤を添加して 取込み反応を停止 32P 取込み反応 外部基質として [32P]無機リン酸を加える 32P 32P 32P 取込まれた 32P量を測定 32P 32P イオン交換カラムに通し 取込まれなかった[32P]を除去 阻害剤

8. 無機リン酸の交換輸送活性 INVSc1-pYES2 INVSc1-pGPT1 ◆：Pi □：KCl (control) INVSc1-pGPT2 INVSc1-pTPT1

9. McTPT1とMcGPT2の基質特異性

10. McTPT1の無機リン酸輸送の速度論的解析 Eadie-Hofstee plot

11. McGPT2の無機リン酸輸送の速度論的解析 Eadie-Hofstee plot

12. アイスプラントのプラスチド型リン酸cDNAとCAM化に伴う発現量変化アイスプラントのプラスチド型リン酸cDNAとCAM化に伴う発現量変化

13. アイスプラント葉組織から抽出した再構成膜タンパク質の輸送活性アイスプラント葉組織から抽出した再構成膜タンパク質の輸送活性 ■：Pi ▲：TP ○：G6P ●：PEP ◆：control

14. まとめ ・アイスプラントのTPT1およびGPT2はリン酸輸送機能を持っており、アミノ酸配列の相同性から予想された基質特異性を持つことが確認された。 ・無機リン酸輸送のKm値はTPT1＝0.8±0.1 mM、GPT2＝1.5±0.1 mMであることが示された。 ・葉組織の膜タンパク質を再構成した系で、発現の変化に対応する輸送活性の変化が確認できるかもれない。

15. 謝辞 　谷口光隆　先生 （名古屋大学生命農学研究科） 細胞生化学研究室の皆様 本研究をするにあたりお世話になりました、 これらの方々に感謝いたします。