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硕 士 研 究 生 开题报告

硕 士 研 究 生 开题报告. 鼻咽癌细胞中 LMP1 激活端粒酶 机制探讨及对凋亡的影响. 广东医学院病理教研室 研究生：赵同伟 导师：陈小毅 教授. 主要内容. ◆ 立题依据 ◆研究内容 ◆技术路线 ◆预期结果 ◆研究进度及实验安排 ◆经费预算. 立题依据. ◆ LMP1 信号传导通路与端粒酶激活 ◆ LMP1 对凋亡的影响 ◆反义 LMP1 问题. LMP1 与 NPC. ◆LMP1 具有转化能力。 ◆ LMP1 在 NPC 患者中均有较高的检出率。

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  1. 硕 士 研 究 生 开题报告

  2. 鼻咽癌细胞中LMP1激活端粒酶 机制探讨及对凋亡的影响 广东医学院病理教研室 研究生：赵同伟 导师：陈小毅 教授

  3. 主要内容 • ◆立题依据 • ◆研究内容 • ◆技术路线 • ◆预期结果 • ◆研究进度及实验安排 • ◆经费预算

  4. 立题依据 • ◆ LMP1信号传导通路与端粒酶激活 • ◆ LMP1对凋亡的影响 • ◆反义LMP1问题

  5. LMP1与NPC • ◆LMP1具有转化能力。 • ◆LMP1在NPC患者中均有较高的检出率。 • ◆LMP1基因是EB病毒的重要的致瘤基因。 • ◆LMP1与NPC的研究涉及许多领域。

  6. 一、LMP1信号传导与端粒酶激活 • ◆（一）LMP1的结构 • ◆（二）LMP1的信号传导通路 • ◆（三）LMP1信号传导与端粒酶的激活

  7. （一）LMP1的结构 • ◆LMP1是跨膜蛋白，包括三个功能不同的结构域。 • ◆羧基端胞浆域是LMP1的基本功能区。

  8. 羧基端胞浆域 • ◆CTAR1诱导低水平的NF-kB。 • ◆CTAR2诱导高水平NF-kB。 • ◆CTAR3位于CTAR1与CTAR2之间，可激活JAK/STAT通路。

  9. （二）LMP1的信号传导通路 • ◆LMP1蛋白的信号传导不需要配体，传导途径和CD40类似。 • ◆胞浆的羧基端胞浆域相互凝集，而后和相关蛋白结合而激活NF-kB 、AP-1及STAT等信号传导通路。

  10. LMP1与NF-kB通路 • ◆通过TRAFs、TRADD途径激活Ik激酶，使IkB磷酸化，导致IkB/NF-kB水解分离，NF-kB转位至核内，发挥功能。

  11. NF-kB通路效应 • ◆上调凋亡抑制基因A20、bcl-2、bfl-1和CIAPS； • ◆一定范围内诱导鼻咽上皮端粒酶表达。 • ◆上调VEGF和MMP9，改变CD40、CD54等。

  12. LMP1与STAT通路 • ◆LMP1已被证实可以激活JAK/STAT通路。 • ◆Chen H等发现LMP1的表达提高了Hela-Bax、CNE2-LNSX及CNE2-LMP1细胞磷酸化的STAT3和STAT5水平。

  13. JAK/STAT通路效应 • ◆参与基因的转录和多种细胞功能如增殖、凋亡和诱导细胞表面标志的表达。 • ◆提示LMP1激活的JAK/STAT通路可能参与了鼻咽癌的发病过程。

  14. LMP1信号传导模式图

  15. （三）LMP1信号传导与端粒酶激活

  16. 端粒酶与肿瘤 • ◆已证明，约90%的恶性肿瘤组织都存在端粒酶的活性。 • ◆端粒酶的激活被认为是细胞逃逸衰老和危机期而永生化的机制之一。

  17. ◆Steven Artandi等推断端粒酶在癌变过程中除了延长端粒的长度，还可能通过某些未知的机制来促进致癌物的产生。 ◆两者关系密切，但总的来讲，尚缺乏直接证据，需要突破。

  18. LMP1与端粒酶 • ◆杨静课题组端粒酶实验三步曲

  19. ◆杨静等发现用EB病毒和TPA作用的人胚胎鼻咽上皮细胞逃避了老化期，最终死亡。◆杨静等发现用EB病毒和TPA作用的人胚胎鼻咽上皮细胞逃避了老化期，最终死亡。 ◆老化前期的端粒酶活性高于后期，而后逐渐转变为阴性。 ◆提示EBV激活端粒酶可能是诱导细胞逃避老化期的机制之一；端粒酶失活和细胞未能逃逸危机期有关。

  20. ◆LMP1表达提高了端粒酶的活性，提示LMP1可以激活端粒酶。◆LMP1表达提高了端粒酶的活性，提示LMP1可以激活端粒酶。 • ◆在LMP1水平最高时端粒酶的活性下降，提示LMP1可能通过不同的机制实现对端粒酶的调控，不同的表达水平各种机制所起的作用可能不同。 • ◆◆LMP1可以通过激活NF-kB激活端粒酶。

  21. 思考： • ◆NF-kB激活后，通过什麽靶基因来激活端粒酶哪？这是本课题研究的核心。 • ◆有无其它激活机制？

  22. 类比文献 • ◆McMurray HR等发现HPV-16 E6通过c-myc对hTERT的转录激活提高了端粒酶的活性。 • ◆LMP1和E6/7蛋白作用有很多相似性。

  23. 假设成立吗？ ◆LMP1 NF-kB、JAK/STAT c-myc hTERT mRNA 端粒酶 ？ ◆端粒的长度哪？

  24. 假设通路相关文献

  25. LMP1与c-myc • ◆孙宁、陈小毅等体外EBV感染人胚胎鼻咽上皮，发现c-myc被激活。 • ◆Chen H等发现在CNE2-LMP1及Hela-Bax中LMP1的表达提高了c-myc的表达。

  26. ◆Kawanishi M发现无血清培养的Jurkat中， LMP1表达，c-myc表达下降。 ◆提示LMP1与c-myc的关系复杂性,LMP1在不同的情况下可能通过不同的方式调控c-myc的表达。

  27. NF-kB与c-myc • ◆c-myc基因上有NF-kB结合位点，即URE和IRE，NF-kB可反式激活c-myc。 • ◆Duyao MP、Kessler DJ等人发现，HLV-1Tax蛋白通过NF-kB反式激活c-myc。

  28. ◆Kirillova I等发现LE6细胞中，TNF通路中 c-myc、STAT3及Il-6的mRNA的改变均依赖NF-kB的激活。 ◆由此可以看出激活NF-kB可以提高c-myc的表达。

  29. JAK/STAT与c-myc • ◆Chen H等也发现在永生化的B细胞中及鼻咽癌细胞CNE2-LMP1中JAK/STAT的激活可以提高c-myc的表达。 • ◆有力支持！

  30. c-myc与hTERT的转录、端粒酶的激活 • ◆hTERT被认为是端粒酶的催化亚基，hTERT转录水平及表达水平的提高可以激活端粒酶，提高端粒酶的活性。

  31. ◆已证明c-myc在hTERT基因启动子区域有至少两个结合位点，还存在协同转录结合位点。◆Horikawa I等又发现hTERT的启动区内激活启动子最大活性的必须区域是5’端的一个59bp区域，其内潜在 c-myc结合位点即E盒结构。

  32. 二、LMP1对凋亡的影响

  33. 凋亡与肿瘤 • ◆多数肿瘤细胞中均存在凋亡的异常。 • ◆肿瘤的发生和发展是增殖和凋亡动态平衡破坏的结果。 • ◆凋亡与肿瘤的研究目前仍集中在表达异常凋亡的活化与抑制基因领域。

  34. LMP1对凋亡的影响 • ◆LMP1似乎在不同的细胞及不同情况下对凋亡相关基因的表达及凋亡产生不同的影响。

  35. LMP1与bcl-2、mcl-1的表达 • ◆S Masciarelli等发现B95.8中LMP1表达下降并未改变bcl-2、mcl-1的表达。 • ◆Jamier L等发现一些EBV感染的细胞株中随LMP1的表达下降，bcl-2及mcl-1的表达下降。

  36. LMP1与A20的表达 • ◆ Kawanishi M等发现肠上皮407株中LMP1的表达上调A20的表达。 • ◆Zhang X 等发现Hela中，LMP1表达，A20上升，bcl-2下降，认为LMP1对凋亡的作用可能依赖于凋亡的触发机制。

  37. LMP1对NPC凋亡的影响 • ◆Wang C等发现LMP1通过NF-kB途径而诱导TRAF1抑制凋亡，可能是抑制凋亡的机制。 • ◆陈燕、陈小毅等发现LMP1在诱导凋亡过程中起促进作用，下调bcl-2，上调bax。

  38. 问题： • ◆在NPC中，LMP1对A20、bcl-2、mcl-1及效应性Caspase3的表达有什麽影响？ • ◆对凋亡有什麽影响？（两种情况）

  39. 综合思考 • ◆综合上述两项，在NPC中LMP1表达、端粒酶的活性与凋亡之间是否存在相关性？

  40. 三、反义LMP1问题

  41. 意图 • ◆将反义LMP1寡聚合苷酸引入LMP1的研究，增加科研的论证强度。 • ◆研究反义LMP1对NPC细胞的影响。

  42. 国内研究 • ◆反义LMP1目前主要应用反义DNA。 • ◆国内李宝民等采用逆转录病毒反义LMP1载体分别作用于细胞株CNE2、CNE3，结果发现LMP1的表达明显受抑，细胞的生长受抑。

  43. 国外研究 • ◆意大利学者E Mattia、S Masciarelli等应用AS2（CTCTCAAGGTCGTGTTCCAT）作用于细胞系B95.8， LMP1表达明显下降。 • ◆Jamier L等将反义LMP1(5-AAG GTC GTG TTC CAT-3)转入一些EBV阳性的细胞系中，LMP1的表达明显受抑。

  44. 装载工具——脂质体 • ◆脂质体可以运载大小不同的基因片段。 • ◆能保护所带基因不受核酸的作用。 • ◆性质稳定，4℃时放置5-6个月，脂质体内仍保留部分DNA分子。

  45. 研究内容（一） • ◆1 临床标本中，检测LMP1，c-myc、bcl-2表达与端粒酶活性。 • ◆2 在NPC细胞中检测端粒酶活性、端粒长度、LMP1、NF-kB、STAT3/STAT5、c-myc及hTERTmRNA的水平。

  46. ◆4检测各细胞系凋亡及相关蛋白A20、bcl-2、mcl-1、Caspase3。◆4检测各细胞系凋亡及相关蛋白A20、bcl-2、mcl-1、Caspase3。 ◆5 无血清诱导凋亡，检测凋亡及相关蛋白的变化。 研究内容（二）

  47. 研究内容（三） • ◆6 综合结果，探讨LMP1、端粒酶活性及凋亡的相关性。

  48. 技术路线 ◆分组 ◆技术路线图 ◆检测方法

  49. 分组 ◆临床标本：分鼻咽黏膜慢性炎、鼻咽低分化鳞癌两组，各25例。 ◆鼻咽癌细胞系：分CNE1、CNE1-GL、CNE1-G、CNE1-GL-RL四组。 ◆注：CNE1-GL-RL为转入脂质体包裹的反义LMP1寡聚核苷酸的CNE1-GL细胞。

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