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ﾋﾞﾀﾐﾝ B12 と葉酸の測定法と基準法の検討（その２）

ﾋﾞﾀﾐﾝ B12 と葉酸の測定法と基準法の検討（その２）. 標準物質の反応性に関する検討 日本ﾋﾞﾀﾐﾝ標準化検討協議会. はじめに. 健常女子学生 58 例の葉酸、 VB12 測定値が測定ｼｽﾃﾑによって乖離し、その測定値の 95% 分布範囲が厚生労働省の定める基準値以下を含んでいるものが認められた。 これらの違いは試薬の反応性、ｷｬﾘﾌﾞﾚｰﾀの組成、値付け方法の違いが原因と推測された。. 目的.

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ﾋﾞﾀﾐﾝ B12 と葉酸の測定法と基準法の検討（その２）

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  1. ﾋﾞﾀﾐﾝB12と葉酸の測定法と基準法の検討（その２）ﾋﾞﾀﾐﾝB12と葉酸の測定法と基準法の検討（その２） 標準物質の反応性に関する検討 日本ﾋﾞﾀﾐﾝ標準化検討協議会

  2. はじめに • 健常女子学生58例の葉酸、VB12測定値が測定ｼｽﾃﾑによって乖離し、その測定値の95%分布範囲が厚生労働省の定める基準値以下を含んでいるものが認められた。 • これらの違いは試薬の反応性、ｷｬﾘﾌﾞﾚｰﾀの組成、値付け方法の違いが原因と推測された。

  3. 目的 葉酸、VB12の測定値がケンタウルスシステム、アクセスシステムおよびエクルーシスシステムで乖離する原因を探り、二次標準物質等でこの乖離を一律に補正することが可能かどうか検討する。

  4. 測定システム1．葉酸 ケンタウルスシステム アクセスシステム エクルーシスシステム 測定原理 競合法（CLIA) 競合法（CLEIA) 競合法（ECLIA) ｷｬﾘﾌﾞﾚｰﾀ 5-ﾒﾁﾙﾃﾄﾗﾋﾄﾞﾛ葉酸 ﾌﾟﾃﾛｲﾙｸﾞﾙﾀﾐﾝ酸 ﾌﾟﾃﾛｲﾙｸﾞﾙﾀﾐﾝ酸 結合蛋白 ウシ由来結合蛋白 ウシ由来結合蛋白 牛乳由来結合蛋白 希釈液 ヒト血清アルブミン ヒト血清アルブミン ウシ血清アルブミン 発売元 ﾊﾞｲｴﾙﾒﾃﾞｨｶﾙ㈱ ﾍﾞｯｸﾏﾝ･ｺｰﾙﾀｰ㈱ ﾛｼｭ･ﾀﾞｲｱｸﾞﾉｽﾃｨｯｸｽ㈱

  5. 測定システム2．VB12 ケンタウルスシステム アクセスシステム エクルーシスシステム 測定原理 競合法（CLIA) 競合法（CLEIA) 競合法（ECLIA) ｷｬﾘﾌﾞﾚｰﾀ シアノコバラミン シアノコバラミン シアノコバラミン 結合蛋白 ブタ内因子 ブタ内因子 ブタ内因子 希釈液 ヒト血清アルブミン ヒト血清アルブミン ウシ血清アルブミン 発売元 ﾊﾞｲｴﾙﾒﾃﾞｨｶﾙ㈱ ﾍﾞｯｸﾏﾝ･ｺｰﾙﾀｰ㈱ ﾛｼｭ･ﾀﾞｲｱｸﾞﾉｽﾃｨｯｸｽ㈱

  6. 検討内容 １．測定法の基礎的検討 　　　標準物質の保存安定性 　　　標準物質の凍結融解安定性 　　　各測定法の希釈直線性 　　　ｷｬﾘﾌﾞﾚｰﾀｰ､ｺﾝﾄﾛｰﾙのｸﾛｽﾁｪｯｸ ２．各測定試薬とﾌﾟﾃﾛｲﾙｸﾞﾙﾀﾐﾝ酸（PGA），5-ﾒﾁﾙﾃﾄﾗﾋﾄﾞﾛ葉酸(5MTHF)およびｼｱﾉｺﾊﾞﾗﾐﾝ、ﾒﾁﾙｺﾊﾞﾗﾐﾝとの反応性試験

  7. 保存安定性試験 プテロイルグルタミン酸 　　　　　　　　　　　（PGA) 5-メチルテトラヒドロ葉酸 　　　　　　　　　（５MTHF） －２０℃保存 ｹﾝﾀｳﾙｽで測定 －２０℃保存 ｱｸｾｽで測定 －２０℃保存 メチルコバラミン シアノコバラミン ｴｸﾙｰｼｽで測定

  8. -20℃保存安定性試験(PGA) 20.0 15.0 葉酸測定値 (ng/mL) 10.0 5.0 ケンタウルス アクセス 0.0 エクルーシス 0 1 2 5 7 14 21 保存日数

  9. -20℃保存安定性試験(5MTHF） 15.0 10.0 葉酸測定値 (ng/mL) 5.0 ケンタウルス アクセス 0.0 エクルーシス 0 1 2 5 7 14 21 保存日数

  10. -20℃保存安定性(ｼｱﾉｺﾊﾞﾗﾐﾝ) 2000 1500 VB12測定値 (pg/mL) 1000 500 ケンタウルス 0 アクセス 0 1 2 5 7 14 21 保存日数

  11. -20℃保存安定性(ﾒﾁﾙｺﾊﾞﾗﾐﾝ) 1500 1200 900 VB12測定値(pg/mL) 600 300 ケンタウルス 0 アクセス 0 1 2 5 7 14 21 保存日数

  12. 凍結融解試験 凍結融解 ｹﾝﾀｳﾙｽで測定 凍結融解 ｱｸｾｽで測定 凍結融解 ｴｸﾙｰｼｽで測定

  13. 凍結融解試験(PGA) 15.0 10.0 葉酸測定値 (ng/mL) 5.0 ケンタウルス アクセス 0.0 エクルーシス 0 1 2 3 融解回数

  14. 15.0 10.0 葉酸測定値 (ng/mL) 5.0 ケンタウルス アクセス 0.0 エクルーシス 0 1 2 3 融解回数 凍結融解試験(5MTHF）

  15. 凍結融解試験(VB12)ｹﾝﾀｳﾙｽｼｽﾃﾑ 1200 900 VB12測定値(pg/mL) 600 300 ｼｱﾉｺﾊﾞﾗﾐﾝ 0 ﾒﾁﾙｺﾊﾞﾗﾐﾝ 0 1 2 3 融解回数

  16. 希釈試験 ｹﾝﾀｳﾙｽ専用希釈液 ｹﾝﾀｳﾙｽで測定 アクセス専用希釈液 ｱｸｾｽで測定 エクルーシス専用希釈液 ｴｸﾙｰｼｽで測定

  17. 30.0 25.0 20.0 葉酸測定値 (ng/mL) 15.0 10.0 ケンタウルス 5.0 アクセス エクルーシス 0.0 0 0.25 0.5 0.75 1 希釈比率 希釈試験(PGA)

  18. 8.0 6.0 葉酸測定値 (ng/mL) 4.0 2.0 ケンタウルス アクセス エクルーシス 0.0 0 0.25 0.5 0.75 1 希釈比率 希釈試験(5MTHF)

  19. 1200 1000 800 VB12測定値 (pg/mL) 600 400 200 ケンタウルス 0 エクルーシス 0 0.25 0.5 0.75 1 希釈比率 希釈試験(ｼｱﾉｺﾊﾞﾗﾐﾝ)

  20. 1000 800 600 VB12測定値 (pg/mL) 400 200 0 ケンタウルス 0 0.25 0.5 0.75 1 エクルーシス 希釈比率 希釈試験(ﾒﾁﾙｺﾊﾞﾗﾐﾝ)

  21. 20.0 15.0 葉酸測定値 (ng/mL) 10.0 5.0 ケンタウルス アクセス 0.0 エクルーシス 0 5 10 15 20 表示値(ng/mL) 葉酸ｸﾛｽﾁｪｯｸ(ｹﾝﾀｳﾙｽ)

  22. 25.0 20.0 15.0 葉酸測定値 (ng/mL) 10.0 5.0 ケンタウルス アクセス 0.0 エクルーシス 0 5 10 15 20 25 表示値 (ng/mL) 葉酸ｸﾛｽﾁｪｯｸ(ｱｸｾｽ)

  23. 25.0 20.0 15.0 葉酸測定値 (ng/mL) 10.0 5.0 ケンタウルス アクセス 0.0 エクルーシス 0 5 10 15 20 25 表示値(ng/mL) 葉酸ｸﾛｽﾁｪｸ(ｴｸﾙｰｼｽ)

  24. ３ ２ １ 0 ４ 0 １ ２ ３ ４ 反応性試験 【葉酸】 【VB12】 上記の割合で混合したｻﾝﾌﾟﾙを各測定法にて測定

  25. 300 250 200 150 回収率 (％) 100 50 ケンタウルス 0 アクセス 0:4 1:3 2:2 3:1 4:0 エクルーシス 混合比(ＰＧＡ：５MTHF) 葉酸反応性試験

  26. 140 120 100 80 回収率 (％) 60 40 ケンタウルス 20 アクセス 0 エクルーシス 0:4 1:3 2:2 3:1 4:0 混合比(ﾒﾁﾙｺﾊﾞﾗﾐﾝ:ｼｱﾉｺﾊﾞﾗﾐﾝ) VB12反応性試験

  27. 反応性一覧 葉酸 VB12 PGA 5MTHF ｼｱﾉｺﾊﾞﾗﾐﾝ ﾒﾁﾙｺﾊﾞﾗﾐﾝ ｹﾝﾀｳﾙｽｼｽﾃﾑ 244.8 61.5 109.8 96.0 － ＞ － ｱｸｾｽｼｽﾃﾑ 92.8 56.3 ｴｸﾙｰｼｽｼｽﾃﾑ 206.6 47.3 114.5 102.7 理論値　１００　に対する割合

  28. 結果 １．葉酸、VB12測定に使用した３種のｼｽﾃﾑは基本性能で良好であった。 ２．葉酸、VB12とも、その構成する成分によって測定試薬との反応性に違いが認められ、特に葉酸では5MTHFがいずれの試薬にも50%前後の反応性であったがPGAに対しては、ｱｸｾｽで90%、ｴｸﾙｰｼｽでは200%、ｹﾝﾀｳﾙｽでも240%を示した。VB12においては葉酸ほど顕著ではなかったがｼｱﾉｺﾊﾞﾗﾐﾝに対する反応性がいずれのシステムにおいても高かった。

  29. まとめ • 葉酸、VB12はそれを構成する成分により試薬との反応性が異なるため一律に比較することは困難である。 • 生体成分では個々に葉酸や、VB12を構成する成分比率が異なる可能性があるため、生体中の葉酸、VB12濃度を比較するためにはそれぞれの成分を個別に評価する、あるいは各構成成分と等しく反応する測定試薬の開発が必要である。

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