סוגי תרביות – עפ"י שלב התפתחות התרבית

1. נושא 3 שקופיות 5 - 21 סוגי תרביות – עפ"י שלב התפתחות התרבית רקמת בע"ח / רקמה עוברית שעברה פירוק מכאני ואנזימי עם טריפסין רקמת עוברית של בע"ח / אדם תוך 2 שבועות • שקיעת התאים בתרחיף וספיחתם לשטח הפנים של הכלי/ הנשא • בעזרת חלבונים גליקופרוטאינים ( בנסיוב) הם נאחזים במשטח הגידול • התאים משתטחים על פני המשטח שאליו נצמדו • התא סיים את הסתגלותו ומתחיל להתחלק והתרבות • נוצר רובד תאים חד-שכבתי על פני המשטח ( תרבית ראשונית ) • הפעלת מנגנון " עיכוב ע"י מגע " העוצר את ההתרבות ומגביל אותה • לגודל לשטח הפנים של המשטח בלבד. התאים נוגעים זה בזה אך • לא עולים אחד על השני . קבלת תרבית ראשונית תרבית חד-שכבתית הטרוגנית מבחינת סוג התאים אחרי השבוע ה 2 • טיפול מכאני / אנזימי ( טריפסין )לפירוק רובד התאים • סרכוז והרחפה של התאים במצע הגידול , דילול • וזריעה חוזרת בכלים חדשים ( העברה ). • מתקבל רובד חד-שכבתי של תאים בצלחות החדשות • חוזרים על ההעברה ( העברות חוזרות) • בהעברות החוזרות מתרחש תהליך ברירה טבעית • ( חלק מהתאים מת וחלק מזערי שורד ) • מתקבלת תרבית שניונית קבלת תרבית שניונית תרבית חד-שכבתית הומוגנית יותר מבחינת סוג התאים בגלל תהליך הברירה שהתרחש בהעברות החוזרות 5

2. העברות חוזרות של תרבית שניונית במשך 12 שבועות בתרבית השניונית ממשיך להתרחש תהליך הברירה באופן הדרגתי ואוכלוסיות תאים שונות נעלמות מהתרבית . האוכלוסייה המתאימה ביותר לתנאי הגידול תתרבה ( יש לה עדיפות ) ותשתלט על התרבית ויתקבל קו תאים הומוגני יותר מבחינת סוג התאים( עדיין לא שבט ) למשל תאים פיברובלסטים או תאי אפיתל ( תלוי בגורם הבורר במצע הגידול ). אורך חייו של קו תאים מוגבל. התאים ימותו או שחלקם יעברו התמרה סרטנית ויתקבל קו תאים רציף . קו תאים אוכלוסיה דומיננטית הומוגנית יותר של תאים השולטת בתרבית במשך 50 העברות חוזרות בשבוע 13 – 14 • התאים בתרבית מתים . חלק מזערי של התאים בקו התאים לא מת , אלא עובר התמרה סרטנית ורוכש יכולת התרבות נצחית • בתרבית ( מחוץ לגוף החי ) ויצר קו תאים רציף • המוחק בתרבית לנצח ע"י המשך העברות חוזרות . • ניתן להקפיא את התאים מקו תאים רציף ליצירת מאגר לשעת הצורך. • סיבות ההתמרה: • ספונטאנית בתנאי הגידול • מושרית ע"י הדבקה בווירוס • מכוונת ע"י איחוי התאים עם תא סרטני • מכוונת ע"י שינוי גנטי בהנדסה גנטית קו תאים רציף אוכלוסיה הומוגנית של תאים המתחלקת ומתרבה ללא הגבלה בתרבית . מתקבלת לאחר 50 - 70 העברות חוזרות תרבית תאים • תאי בע"ח או אדם הניתנים לגידול בתרבית בקלות יחסית , לרוב הם : • תאי רקמת החיבור : פיברובלסטים ( תאי העור ) , תאי אנדותל (רקמת ציפוי פנימית ) • תאי רקמת ציפוי : תאי אפיתל (רקמת ציפוי עילית ) • תאי כלאיים ( תאים שעברו איחוי ) : תאי היברידומה המייצרים נוגדנים חד-שבטיים 6

3. סיכום סוגי תרביות סוג התרבית בע"ח 0 2 שבועות תרבית ראשונית Primary culture תרבית ראשונית 2 העברה תרבית שניונית 4 תרבית שניונית secondary culture 12 שבועות 70 העברות חוזרות ( מינימום ) זמן הדור 20-48 שעות קו תאים קו תאים Cell line בשבוע ה 14 הזדקנות ודעיכה התמרה סרטנית בשבוע ה 16 בשבוע ה 16 מות התרבית קו תאים רציף 16 קו תאים רציף continuous Cell line ציר הזמן (שבועות) תרבית נצחית 7

4. השלבים בהתפתחות רובד תאים חד-שכבתי בתרבית על משטח תאחיזה ספיחה של חלבוני הקישור (חלבוני תאחיזה במצע ) למשטח גידול הידרופילי 1 מגע התאים עם המשטח המצופה בחלבוני קישור 2 התקשרות התאים למשטח באמצעות חלבוני הקישור 3 השתטחות והתפרשות התאים והצמדתם למשטח הגידול 4 התחלקות והתרבות התאים על-פני משטח הגידול 5 רובד תאים חד-שכבתי נוצר על משטח הגידול 6 המעבר לתרבית תאים זהו מעבר הדרגתי ובררני המתפתח בשלבים תרבית תאי אנדותל 8 http://biomed.wustl.edu/faculty/elbert/Elbert%20Lab/endothelial_cell_biology.htm

5. אנימציה על התפתחות תרבית http://www.bme.gatech.edu/vcl/Tissue_Engineering/Background/5_cell_seeding.htm 9

6. סרטון על מותה של תרבית סרט וידיאו על תרבית תאים כולל שלבי תמותה (אפופטוזיס) Controlling cell proliferation and cell death (apoptosis) Click here to watch a video clip of apoptosis in action http://www.bham.ac.uk/chemeng/actg/actghome.htm 10

7. מנגנון היצמדות התאים בתרבית ויצירת תאחיזה למשטח הגידול העשרה באמצעות גורמי קשירה טעונים + 1. הוספת גורמי קשירה בעלי מטען חשמלי חיובי + כמו חלבונים גליקופרוטאינים או יונים דו-ערכיים (יוני סידן) + + + + + + 2. טעינת המשטח ב + ע"י ספיחת גורמי הקשירה החיוביים + + + + + + 3. הוספת התאים (קרום התאים טעון שלילי - ) - - - - - - + + + + + + 4. יצירת מגע בין התאים למשטח - - - - - - 5. התקשרות התאים למשטח באמצעות הגליקופרוטאינים + + + + + + - 6. השתטחות התאים והתחלת ההתרבות - - - - - - + + + + + + 11

8. העשרה תאי אדם מרקמות שונות שהצליחו לגדל בתרבית http://www.hansei.com/products/products02.htm 12

9. צורות גידול של תאים בתרבית – לפי סוג התאים תאים נורמאליים תאים סרטניים גידול רב-שכבתי גידול בתרחיף גידול חד-שכבתי • תאי בע"ח נורמאליים שמקורם ברקמות חיבור או רקמות ציפוי (תאי עור או אפיתל ) נצמדים למשטח תומך ,משטחים ומתרבים עליו. הם יוצרים רובד תאים חד-שכבתי מסודר . גידולם נעצר. • דורשים תאחיזה למשטח מוצק • יש עיכוב ע"י מגע • תאי בע"ח סרטניים יכולים לגדול בצורת תרחיף במצע נוזלי • או יוצרים גושי תאים לא מסודרים ורב- שכבתיים על מצע מוצק • לא דורשים תאחיזה למשטח • אין עיכוב ע"י מגע • תאי דם ולימפה נורמאליים של בע"ח מתרבים בצורה חופשית במצע נוזלי כתאים בודדים או בצברים קטנים. הם יוצרים תרחיף תאים . • לא דורשים תאחיזה למשטח מוצק 13

10. תנאי הגידול של תאים בתרבית כלי הגידול בקרת הגידול מצע הגידול • כלי הגידול מסוגים שונים : • עשויים פלסטיק שקוף בעל מכסה הסוגר בצורה חופשית לא הרמטית כדי לאפשר נשימה וחילוף גזים) • צלחות פטרי • צלחות עם בארות ( מולטי) • בקבוקי מיוחדים לשימוש אופקי • מגירות / סלילים / חרוזים – להגדלת יחס שטח הפנים לנפח • הכלל : שטח פנים מקסימאלי ונפח מצע מינימאלי בגלל : • 1. יוקר המצע 2. לאפשר מגע של התאים עם האוויר • התנאים מבוקרים ודומים לתנאים בגוף : • טמפרטורה 37 מעלות • סביבה ניטרלית pH = 7.2 -7.4 • איזון אוסמוטי קפדני (התאים רגישים ללחץ אוסמוטי בהיותם מוקפים בקרום בלבד • אוורור (אספקת חמצן) בתוספת 5% גז CO2לאיזון pH המצע . • אינדיקטור פנול אדום במצע ( מצהיב ב pH חומצי ) • סביבה סטרילית ( עבודה במנדף סטרילי , שימוש במצע מסונן המכיל אנטיביוטיקה, אוויר מסונן ) • המצע מורכב עשיר ויקר ומכיל : • מקור סוכר (גלוקוז) • מלחים אנאורגנים • חומצות אמיניות • ויטמינים • אנטיביוטיקה (נגד זיהום חיידקי) • נסיוב מן החי ( מכיל גורמי תאחיזה וגורמי גידול והתרבות ) ויסות ושמירה על ה pH של מצע הגידול : הזרמת 5% גז CO2 באוויר לוויסות חומציות המצע : הפחמן דו חמצני נמס בתמיסת המצע ויוצר חומצה חלשה המקיימת מצב שיווי משקל עם האניון שלה . נוצרת מערכת בופר הבולמת שינויים בריכוז הפרוטונים בתמיסה עקב חילוף החומרים בתאים הגדלים בתרבית . בקבוקי תרבית לשימוש אופקי 14

11. בקרה של פרמטרים חיוניים לגידול תרבית אנימאלית ( של בע"ח ואדם ) : • PH • טמפרטורה • חמצן ( אוורור ) • סטייה של ערכי המדדים האלה מהנדרש תגרום למותה של תרבית תאי בע"ח • ריכוז המזון במצע • ריכוז פסולת רעילה http://www.bham.ac.uk/ChemEng/actg/actgres.htm 15

12. גידול תעשייתי של תרבית תאי בע"ח - עפ"י העיקרון : שטח פנים מקסימאלי ונפח מצע מינימאלי גידול תאים בבקבוק סובב תיאור המערכת : • בקבוקי זכוכית בנפח 2 ליטר כ"א, מסתובבים במצב אופקי על ציר האורך שלהם, באופן רציף. • שטח פני הבקבוק הפנימי מותאם לספיחת תאים ולתאחיזה. • הפאזה הגזית גדולה כי נפח המצע קטן . • רובד התאים פעם טבול במצע ופעם נחשף לאוויר ( לחמצן ) • יתרונות : • צמצום סכנת זיהום של כלל התרבית . אם יש זיהום אז הוא מוגבל לבקבוק בודד בלבד . • שטח הפנים גדול יחסית לנפחו. הרובד מצפה את שטחו הפנימי. • כמות המצע מינימאלית . חסכון כלכלי . • הפאזה הגזית גדולה ( חלל הבקבוק גדול ) ומאפשרת חילוף גזים. • זמינות המצע לתאים טובה . • חסרונות: התהליך מנתי. העבודה עם הרבה בקבוקים מסורבלת ולא נוחה. דוגמה לשימוש במערכת : ייצור תרכיבי חיסון 16

13. מערכת הבקבוק הסובב לגידול תאי בע"ח http://www.eyela.co.jp/seihinEX/catalog/sogo_catalog/18Edobutsu.html 17

14. גידול תעשייתי של תרבית תאי בע"ח - עפ"י העיקרון : שטח פנים מקסימאלי ונפח מצע מינימאלי גידול תאים על מיקרו נשאים תיאור המערכת : כדורים קטנים בקוטר 150-200 מיקרון המורחפים במצע הגידול עם התאים. התאים נצמדים לשטח הפנים של הכדורים נאחזים בו ועליו מתחילים להתחלק ולהתרבות עד שיוצרים על כל כדור מעטפת רקמתית בצורת רובד תאים חד-שכבתי הגידול על נשאים יכול להיות מנתי או רציף מיקרו נשאים ועליהם גדלים תאים http://www.microcarriers.com/cytodex.html גידול בתהליך רציף גידול בתהליך מעורבל ( מנתי ) מזרימים מצע ברצף לתרבית , ומרחיקים בו זמנית את המצע המשומש דרך מסנן לשימוש חוזר ( המצע ממוחזר ) מספקים מצע טרי + ערבול עדין התאים מתרבים במיכל הגידול כשיש הצטברות פסולת עקב הגידול וירידה בכמות חומרי המזון מסננים מצע ישן ומחליפים במצע טרי יתרונות הרציף (פרפוזיה) : חסכון במצע יקר. ריכוז המצע קבוע ריכוז החמצן קבוע צפיפות התאים גבוהה יותר חסרונות גידול מעורבל -מנתי : לא ניתן להגיע לביומסה גדולה כי צפיפות הגידול של התאים קטנה יותר 18

15. תכונות המיקרו נשאים המשמשים בגידול תרביות תאים : • כדורים קטנים ( 0.1-0.25 מ"מ ) • עשויים פולימר טבעי מצולב ומותמר במטען חיובי כמו צלולוז ,דקסטרן (פולימר טבעי של גלוקוז) , קולגן או עשויים פולימר סינתטי לא רעיל . • בעלי מבנה גמיש ( הקטנת נזק התנגשויות העלול להיגרם לרובד התאים ) • בעלי תכונות אופטיות (בליעת אור באורך גל מסוים מאפשרות מעקב מיקרוסקופי אחר גידול התאים) • מאפשרים גידול בתרחיף עם ערבול עדין • ניתנים להפרדה מהמצע ( הפסקת הערבול תגרום לשקיעתם ) • מאפשרים גידול רציף • המערכת קלה יותר לבקרה ולוויסות הפרמטרים המשתנים • יחס שטח פנים לנפח של הנשאים גדול • מאפשרים קבלת צפיפות גבוהה של תאים המצפים ברובד חד-שכבתי את הנשאים • חסכוני וכלכלי כי משתמשים בנפח מצע קטן יחסית • סיכויים לזיהום חיידקי קטנים יותר • חוסך העברות חוזרות • המעבר קל יחסית לנפחים גדולים יותר ולפיתוח ייצור מסחרי מיקרו נשא עטוף בשכבת תאים שגדלו על שטח פניו http://www.percell.se/Kulastor.gif 19

16. מערכת גידול רציפה - ערבול התרבית ע"י הזרמת מצע ממוחזר כלפי מעלה הרחקת המצע המשומש (ללא נשאי התאים) דרך מסנן לשימוש חוזר יתרונות המיקרו נשאים : יחס שטח פנים לנפח גדול מרבי. נפח המצע מינימאלי . חסכון כלכלי . אפשרות הגדלה הדרגתית של נפח העבודה אפשרות השימוש בתרחיף הנשאים בכלים קטנים ונוחים . אפשרות לערבול מתון ולתנאי גידול קבועים מתקבלת צפיפות תאים (ביו מסה) גבוהה אפשרות להפרדה קלה של התאים ממצע הגידול חוסך העברות חוזרות ( מצמצם סכנת זיהום ) אפשרות לתהליך גידול מנתי וגם רציף מסנן עליון אויר + CO2 תרחיף נשאים +תאים מצע הגידול ממוחזר מצע גידול מוזרם כלפי מעלה לערבול מסנן תחתון משאבה 20

17. העשרה רשימת אתרים להרחבה סוגי תאים הגדלים בתרבית , מצעים , סוגי תרביות ושיטות http://www.research.umbc.edu/~jwolf/method5.htm סוג התאים שניתן לרכוש באופן מסחרי למטרות יישומיות http://www.hansei.com/products/products02.htm http://www.bet-analyses.com/frame_right/culturee.html הרכב המצע ותנאי הגידול http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/media.htm תפקיד הנסיוב במצע http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/serum.htm תרבית ראשונית http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/primary.htm http://www.nhnscr.org/stem-cell-culture-course/course-description.htm בקרה 0n-line של תרבית תאי בע"ח http://hugroup.cems.umn.edu/Research/hybridoma/on-line_control.html מערכת מיקרו-נשאים http://www.percell.se/history.htm מערכת הבקבוקים הסובבים http://www.eyela.co.jp/seihinEX/catalog/sogo_catalog/18Edobutsu.html 21