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第八节 分子克隆载体的选择. 1. 选择克隆载体的几个重要参数 1 ）实验对象 2 ）实验性质 3 ）载体容量 4 ）合适克隆位点 5 ）载体的稳定性 6 ）载体 DNA 制备的难易 7 ）外源基因表达产物产量、产物特点等 2. 实验对象 1 ） 供体 ： 遗传背景与 DNA 特点等，其中包括染色体 DNA 大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。
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第八节 分子克隆载体的选择
1. 选择克隆载体的几个重要参数 1）实验对象 2）实验性质 3）载体容量 4）合适克隆位点 5）载体的稳定性 6）载体DNA制备的难易 7）外源基因表达产物产量、产物特点等 2.实验对象 1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。 2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。
常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如： E.coli DH5: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–,recA1, relA1,gyrA96 E.coli DH5α: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–, recA1, relA1,gyrA96; φ80dlacZ△M15, △(lacZYA-argF)U169 E .coliDH5αF’: F’, endA1, hsdR17(rk–,mk+),supE44,thi–,λ–, recA1, relA1, gyrA96,φ80dlacZ△M15, △(lacZYA-argF)U169 i.三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组 ii.DH5α和 DH5αF’都具有一个可供遗传标记lacZα检测的遗传背景 iii.DH5αF’可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要 F’的存在
3.实验性质 分子克隆的一般程序包括以下几步： i. 分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA ⅱ.构建基因文库或cDNA文库 ⅲ.目的基因或cDNA 克隆的筛选 ⅳ.目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等 ⅴ.基因表达与调控机理的研究
1) 建立文库用载体 常在E.coli进行 i.目的基因与供体基因大小 小—质粒载体，操作方便，鉴定简单 大—λ或cos质粒载体, 甚至P1或pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用λ和cos载体） ii.筛选方法 ⅰ)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性) ⅱ)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性 ⅲ)杂交法：各种载体均可 2) 目的基因的鉴定 次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等 定序：定序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体） 3) 基因表达与调控 外源基因可表达—普通载体; 不表达—表达型（分泌）载体
4.载体容量 M13mp载体 <4 kb 细菌质粒载体 <10kb λ载体 <23kb cos质粒载体 <48kb P1载体 <95 kb pYAC载体 ∽1000 kb 5.合适的克隆位点 单克隆位点和多克隆位点
第 九 节 分子克隆载体的组建
构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点，标记基因，载体容量等。构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点，标记基因，载体容量等。 1.克隆位点的建立 1)体外重组 i.减少限制酶识别位点 ii.增加限制酶识别位点：人工接头，匹配接头 2)体内重组或突变 i.减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系列载体时，去除Kanr 基因中的HindIII位点就采用了以下技术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切， 再转化，直至提取单菌落质粒DNA已无法用HindIII酶切为止
ii.增加限制酶识别位点 M13mp系列载体构建中EcoRI位点的建立 体外诱变 体内错配 体外筛选 α-肽链Thr Met Ile Thr Asp Ser M13mp正链5'…ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CT …3' CH3 互补链负链 3'…TAC TGG TAC TAA TGC TTA AGT GA…5' M13mp正链 5'…ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCA CT…3' α’-肽链 Thr Met Ile Thr Asn Ser
2.标记基因的建立 1）启动子 2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围 3）终止子 3.载体容量 尽可能除去无关的DNA序列。
第二章 练习题 1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化E.coli细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样，从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却
不能用限制酶回收该片段。当把同类转化细胞培养液所分离到的DNA进行复性分析时，DNA分子间不会发生复性，但把从不同类转化细胞培养液分离到的DNA进行同样的实验时，发现在电镜下可观察到十分类似于8字形的结构。如何解释上述实验结果? 可利用图示法解释。 4. 由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体，因为复制起点和标记基因具有生物特异性，所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。已知不同生物的某些基因启动子可以在E.coli细胞中启动基因转录，问可以采取一些什么方法减小穿梭载体的分子量? 5. 丝状真菌的分子克隆载体绝大多数都是整合型的。当用丝状真菌突变体作为宿主菌和利用遗传互补法筛选基因时，常常会遇到无法回收到阳性克隆中的基因片段的问题。有的科学家利用λ或cos质粒载体构建文库，然后利用重组分子转化宿主菌，在所获得的阳性克隆中，可用一简单的方法获得所需基因，他是采用何种方法获得该基因的?
6．为了弄清leu2基因的突变位点，一研究生将YIp(含LEU2基因)质粒转入酿酒酵母(Leu-)，然后在无亮氨酸的合成培养基上分离到Leu+转化子，经各种实验证明该质粒已整合到leu2基因旁边，最后他用一种非常简单的方法就将leu2基因分离出来了。他是用何种方法分离该基因的? 可用何种方法证明该基因是突变基因? 画出整个设计图（已知酵母的LEU2基因可与具leuB的E.coli突变体发生遗传互补） 7．当YIp整合到染色体DNA中后，偶尔还会发生再次重组，导致突变基因被野生型基因所取代，现已知有两个转化体分别属于上述两种情况，可用何种方法区别这两种不同的转化体? 8．当YRp质粒转移到酵母细胞后，有时也会发生整合现象，即这种自主复制是质粒可插入到染色体DNA中，现有一个含URA3的YRp质粒，可用何种方法筛选到这种整合型的转化体? 如何证明?
9.有些用于转化的酵母菌株也可发生回复突变，当把YRp质粒转入酵母细胞后，在选择性培养基上生长的大多数为转化体，极少数为回复突变体。现分离到一个菌落，怀疑它为回复突变体，可用什么方法证明此推断? 为避免回复突变体的出现，应选择何种受体菌? 10.可用何种方法使酵母菌株中的天然质粒消除? 简要描述其实验设计，并写明可用什么方法证明其质粒被彻底消除? 11. 现有一BamHI DNA片段， 已知内含有如下限制酶识别位点：PstI, HindⅢ, EcoRI, SalI, KpnI, 它们都只有一个识别位点。一研究者要绘制该片段的上述几种限制酶谱，他手中现有两种克隆载体。其中一种的上述各限制酶识别顺序均集中在一多克隆位点区，而另一载体则分散于整个DNA分子中，他应选择何种载体?为什么?
