第三章 2 动物基因工程

1. 第三章2 动物基因工程 概述 1、动物转基因技术的基本概念 2、外源基因导入动物体内的研究方法 3、动物转基因的载体 1）病毒载体 2）反转录病毒载体 4、转基因动物技术的应用 1）研究基因的表达与功能 2）利用转基因动物或细胞生产生物大分子 3）利用转基因动物细胞生产人体蛋白 4）利用转基因动物技术改良动物 5、克隆动物

2. 概况 1、1982年，美国华盛顿大学R..D.Palmiter等采用显微注射法，将大鼠生长基因导入小鼠受精卵的雄原核内，得到转基因小鼠以来，实现了动物种系内和种系间细胞的基因转移，构建了各种转基因动物。 2、转基因动物技术具有广泛的应用：研究基因的表达与功能，生产生物大分子；生产人体蛋白；改良动物；医用转动物模型。例如研究哺乳动物的基因表达和发育、人类疾病的动物模型系统的建立，在动物乳汁中生产重要的医用蛋白等等。 3、转基因人的研究只能限于体细胞的基因治疗，具有遗传特征修饰的转基因人的研究，可否迈出历史的一步？问题多多。 4、动物基因转移无论用何技术，转移效率极低。

3. 第一节 基本概念 1、定义： 基因转动物（transgenic animal)：指基因组中整合有用转基因技术所导入的外源基因（或特定的DNA片段），整个技术则称为转基因技术(transgenic technology或transgenesis)。 理论上讲任何动物都可以通过性系基因操作成相应的转基因动物（如：鱼、鼠、羊、牛等）

4. 2、动物转基因技术程序 • ①将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中； • ②接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育； • ③移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因； • ④利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。

6. 3、动物转基因的效率 • 动物基因转移的起点和终点分别为受精卵和含有整合转基因的动物子代。在这个过程中，转基因的效率极低。以小鼠转基因为例： • 以小鼠转基因为例： 注射外源基因后受精卵的存活率为86％； 将受精卵移殖到母鼠子宫内后受精卵的存活 率为25％ 母鼠的怀孕率为80％ 转基因在基因组上的整合率为24％ 因此小鼠转基因的总有效率约为4％

7. 4、动物基因的结构 • 1）基因组片段：分子较大，保持较完整的基因结构。 • 2）融合基因：将不同来源的结构基因、非编码序列、 • 表达调控序列重组成杂合单元。 • 3）小基因：分别取同一基因的某一区域或若干区域组成转基因。 • 4）靶基因：结构基因或调控序列经诱变或定向突变处理后，重新输回动物体内。 • 5）插入基因：含有在动物染色体上随机或特异性插入位点，可装标记基因。 • 6）置换基因：两侧含动物基因或其他DNA区域的同源序列。

8. 5、动物转基因的表达特性 • 1.转基因的时空特异性表达 动物基因表达调控的显著特性：时空特异性，特别是在发育过程中，相关基因的时序特异性和组织特异性表达更为严格。 • 2.转基因的可控表达 诱导动物细胞内的转基因，对其稳定高效表达至关重要，转基因的诱导条件取决于受体细胞的性质和启动子的类型。 • 3.转基因的共抑制效应 在转基因动物体内，转基因的表达常会发生转基因的失活，也称为转基因沉默。

9. 共抑制效应特征 • 1）共抑制只发生在转基因与同源的内源性基因之间，对其他的基因表达不产生影响； • 2）如果转基因与内源基因发生体内重组，则共抑制效应随之消失，基因表达恢复正常； • 3）共抑制现象的发生与结构基因的编码区有关，但不依赖于启动子的来源和性质。 • 4）两个相同的转基因之间也能发生共抑制效应。

10. 造成转基因共抑制效应的原因 • 1）转基因与其同源的内源性基因相互作用，形成某种状态而影响两者表达； • 2）转基因与内源基因竞争性结合核基质和核包膜上转录翻译必须的非扩散元件，导致相互抑制； • 3）两者转录出互为反义的RNA结构，使之失活并 迅速降解； • 4）由于转基因的存在，受体细胞中mRNA的大量积累，并激活某些未知酶系的表达，导致mRNA降解。

11. 转基因表达单方面失活的原因 • 转基因动物体内的转基因表达单方面失活，而同源的内源性基因却表达正常。 • 1）转基因被受体细胞识别为异己DNA，并将它甲基化修饰，使其失活； • 2）转基因整合在不合适的染色体部位，受局部条件影响而不表达； • 3）转基因本身的结构不利于其表达。

12. 6、动物转基因的生物学特性效应 1）应用于动物基因组结构与功能的研究 • 以报告基因为转基因探测动物或人基因组中时空特异性表达调控序列； • 以反义基因为转基因灭活相关的内源基因，构建基因表达缺陷－－功能丧失的动物模型，以筛选鉴定人类功能性基因，并为药物提供实验实体； • 以同源基因为转基体内检测其表达特性及产物的生物效应。 • 2）转基因技术改良动物物种 • 3）对人体中数千种分子病的基因治疗 • 4）利用此技术构建优异的动物反应器

13. 为什么要选鼠作转基因动物模型？ 1、人类与老鼠共享着80％的遗传物质和99％的基因，人类和老鼠基因组同源度高，对它进行比较研究可以得知很多关于人类疾病和生理机能的研究，因此了解老鼠非常有助于了解人类本身。 2、由于鼠的生殖周期短，产仔数多，基因整合率较高。饲养成本较低，因此成为转基因动物实验的首选动物。

14. 为什么要选择乳腺来生产药物蛋白? • 1, 奶汁可以由乳腺不断地分泌，而且产量很高，长期收集也不会对动物造成伤害； • 2，将新的药物蛋白限制在乳腺内生产，最后分泌到乳汁中，一般不易对转基因动物的正常生理活动造成影响； • 3，乳腺分泌的蛋白质是经过正常的高等哺乳动物的翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接近于人类自身的蛋白质； • 4，乳汁中蛋白纯化起来相对较为容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白质也为数不多(表12—1)。

16. 第二节 动物转基因的研究方法 • 最早发展并较为完善的系统是小鼠进行转基因实验 • 从20世纪80年代初期到现在，人们已经将上百种不同的基因转人了小鼠，这些研究为进一步了解高等动物的基因表达调控、肿瘤的发生、免疫特异性、胚胎发生、发育过程以及分子遗传学等基础生物学过程做出了重要贡献； • 同时，在判断利用家畜生产人类药物的可行性、构建人类各种遗传疾病的生物医学模型方面，转基因鼠也发挥了重要的作用。

17. 1、转基因技术的主要方法 • 一、利用反转录病毒载体将外源基因转入胚胎早期细胞，然后移植到受体动物中； • 二、利用显微注射法将DNA直接注射入受精卵的精前核中； • 三、将基因工程改造过的胚胎干细胞导入早期胚胎中。 • 用该方法已成功地得到了猪、羊、鸡、免、牛、鱼等多种转基因动物。

18. 2 、 反转录病毒法 在各种基因转移方法中，通过反转录 病毒载体把外源基因整合到受体细胞核基 因组中是目前最有效的方法之一(图12—1)。

19. 图12-1 通过反转录病毒载体获得转基因小鼠

20. 反转录病毒法的缺陷 • 1）反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(＜10kb)。转入的基因易缺少其邻近的调控序列。 • 2）反转录病毒载体因缺失了复制功能序列，在复制载体DNA所用的辅助病毒(helper virus)基因组也可能与目的基因一起整合到同一细胞核中。另外转基因动物自身也有可能产生辅助病毒株。这样转基因动物虽合成了人们所需的产品，但也有可能大量复制病毒。 • 3）目前的技术水平要完全杜绝反转录病毒在转基因动物商品中的污染是很难做到的。因此一般人们很少用反转录病毒载体来制造商业生产的转基因动物。

21. 3、 DNA显微注射法（1） • 用显微注射器把DNA直接注射到动物的细胞质或细胞核中（直接注射和穿刺导入法）。 • 受体细胞： 1）多为沿培养皿壁生长的单层细胞； 2）动物的卵细胞。 • 转化效率：取决于注射DNA性质和注射技巧。

22. 3 、 DNA显微注射法（2） • 向供体雌鼠注射怀孕母马的血清，48h后再注射人的绒毛膜促性腺激素，使其超量排卵，经处理的雌鼠可以产约35个卵细胞/次、正常雌鼠只能产5—10个卵细胞/次。然后，从这些交配后的雌鼠的输卵管中取出受精卵。随后将外源基因注射进受精卵中。 • 微注射的转入基因常要删除原核载体序列的线性DNA。在哺乳动物中，精于进入卵细胞后的l h内，精前核和卵细胞的核都是分开的。等到卵细胞核完成减数分裂，成为卵前核时，核融合才进行，这又称为核配。DNA微注射要在精前核时注射才能有效。精前核比卵前核更大，因此可在显微镜下找到处在精前核状态下的受精卵。并对受精卵进行取向和固定，然后进行DNA微注射(图12—2)。

23. 图12—2 DNA显微注射示意图

24. 3、DNA显微注射法(3) • 注射完成后，用显微外科手术将25—40个受精卵移植到假孕雌鼠的子宫内，制造雌鼠假孕（可以让它与切除了输精管的不育雄鼠交配），将受精卵移入代孕母鼠子宫中大约3周后，接受过注射的受精卵发育生长为幼鼠，由代孕母鼠产下(图12-3)。

25. 图12-3

26. 3、DNA显微注射法(4) • 转基因动物进行检测： • 1）取一小截幼鼠的尾巴，提取DNA进行Southern杂交或PCR检测，看是否存在转入基因。 • 2）将它与另一只鼠进行交配来确定转入基因是否存在其生殖系中。 • 3）通过对子代进行杂交产生纯合的转基因鼠(图12—4)。

27. 图12—4 显微注射法获得的转基因鼠的纯合鼠系 • ■，转基因杂合鼠； 口，未转基因鼠

28. DNA显微注射法的评价(1) • 技术性很强，转基因动物的成功率低，通常发育成转基因动物的受精卵一般占注射受精卵的5％，而每1000个接受微注射的受精卵里能产生30—50只转基因幼鼠。大多数情况下通过微注射法获得转基因动物的成功率只有l/1000。有人用增大微注射受精卵的数目来弥补缺陷。 • 对于显微注射用的DNA的要求高：1）转入的外源基因要能够高效表达，2）可以诱导表达。3）具有帮助提高整合效率的序列。在注射的载体中加上MAR序列(matrix attach region)，这种序列位于染色体的基部，具有隔离作用，可以帮助基因高效表达。4） ，在外源基因两端可加入微卫星序列，因在染色体上也有微卫星序列，两个微卫星序列可以帮助发生同源重组，提高整合效率。

29. 图12—5 用显微注射法获得的几种转基因动物的成活率

30. 图12—6 转入基因的结构示意图。

31. DNA显微注射法的评价(2) • 由于微注射法所注射的DNA在宿主基因组中是随机整合的，并且有可能发生多个拷贝插入同一位点的情况，因此转入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，从而干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢； • 另外，有的外源基因的表达具有时间性，得到的转基因动物可能只在一段时期内表达外源基因；有些个体可能因基因插入位点不合适而无法表达产物；还有些个体基因拷贝数过多导致表达过量，干扰自身的正常生理活动。 • 因此，并不是所有的转基因小鼠都能产生预期的性状。由于这些原因，DNA微注射法的总效率还是比较低，但是这种方法仍然是目前获得转基因鼠的常规方法。

32. 4 、 胚胎干细胞方法 • 多能胚胎干细胞：动物胚泡发育期的胚细胞重新导入另一胚泡期的胚之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力，这种细胞叫做多能胚胎干细胞。 • 胚胎干细胞(embryonic stem cell，简称ES细胞)的获得：分离胚泡的内层细胞团(inner cell mass)进行培养。ES细胞在无饲养层的平板中培养时会持续分化为肌细胞、神经细胞等多种功能细胞，只有在含有成纤维细胞的饲养层或白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor，LIF)的饲养层上生长时，才能保持其未分化状态，保持ES细胞的潜在分化能力(图12—7)。

33. 图12—7 从鼠的胚胎细胞培养胚胎干细胞

34. ES细胞法 • 在ES细胞的培养过程中，可通过基因工程操作，利用反转录病毒载体、电击法等多种方法将外源基因导人ES细胞，而不改变它的分化能力。 • 将有功能的转入基因整合到ES细胞基因组内的某一非必需基因位点上，然后对这些细胞进行筛选培养，用于产生转基因动物(图12—8)。 • 这种方法避免了在DNA微注射法与反转录病毒载体方法中存在的基因随机整合的问题。

35. 图12—8 通过胚胎干细胞获得转基因小鼠示意图 图12－8

36. 图12—10 PCR法检测是否特异整合同源重组示意图

37. 遗传学分析 • 正确整合的转基因胚胎干细胞系经培养后就可以移入胚泡期的胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，这样产生的子代其部分生殖系细胞就是由转基因的ES细胞形成的。然后在得到的转基因鼠间进行杂交，子代再配对杂交。 • 根据孟德尔遗传定律，将有1／4的可能获得纯合的转基因鼠(图12—11)，即转入基因可以和正常基因一样分离。

38. ES方法评价 • 目前，利用ES细胞获得的转基因小鼠主要是用于基础研究。从原理上讲，胚胎干细胞法应当也适用于获得其他转基因动物，但遗憾的是，这种方法目前还没有在牛、羊、猪及鸡等家畜、家禽的研究中使用； • 利用ES细胞获得转基因动物的方法还有一个缺点，就是需要经过多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳动物来说，如牛、羊等，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。

39. 第三节 动物转基因载体 • 一、SV40病毒载体 1. SV40病毒的基本生物学特征 2.取代型重组病毒载体 3.重组的病毒－质粒载体 • 二、反转录病毒载体 1.一般生物学特性 2.主要类型 • 三、其他病毒载体

40. 动物病毒的特点 • 1、有能够被真核细胞识别的有效的启动子； • 2、能够持续地复制使基因 达到相当高浓度，并实现有效的表达； • 3、能有效控制自己的作用因子，长时间的保持高拷贝的外源基因； • 4、能高效稳定地整合到染色体； • 5、病毒外壳蛋白能够识别细胞接受器，能够将外源蛋白高效地导入宿主细胞。

41. SV40病毒 • 1、小型20面体蛋白质颗粒，3种病毒外壳包装一条环型的病毒基因组DNA ； • 2、它的DNA剪辑模型相当复杂； • 3、SV40基因组中存在一个增强子序列，它的功能是促进病毒有效的早期转录，能够促进激发或增强位于邻近的任何启动子的转录活性。

42. 反转录病毒载体类型 • 1、辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体； • 2、无需辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体； • 3、广寄主范围的反转录病毒载体； • 4、反转录病毒表达载体、

43. 第四节 动物转基因的应用 • 人们对于鼠的发育和遗传过程有了比较清晰的认识，同时也形成了一整套比较成熟和完善的技术。因此，有人把鼠称为哺乳动物中的“大肠杆菌”和“酵母”，是人们研究高等哺乳动物基因表达调控和发育的重要工具。转基因鼠还可为研究人类的各种疾病，包括遗传疾病、癌症等疑难病症建立模型系统。

44. 1、人类疾病的转基因动物模型 • 完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，并为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。帮助了解疾病的病因和发展过程。 • 各种人类遗传病的鼠模型，如： • 老年性痴呆症(Alzheimer’sdisease)、 • 关节炎(arthritis)、 • 肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)、 • 肿瘤发生(tumorigenesis)、 • 高血压(hypertension)、 • 神经衰变症(neurodegenenerative disorder)、 • 内分泌功能障碍(endocrinological disfunction)、 • 动脉硬化症及其他很多疾病。

46. 老年性痴呆症研究模型 • 是一种大脑功能衰退疾病，特点是抽象思维能力和记忆力逐渐减退，并常伴随性格改变、语言障碍、动作迟缓等症状。约有1％的60一65岁间的老人，30％的80岁以上的老人都可能患这种病，可惜这种病很难进行临床诊断。 • 研究发现在老年性痴呆症患者大脑的新皮质(neocortex)和海马区(hippocampus)，神经纤维纠结成团在神经元细胞内积累，并在轴突末端形成了浓密的胞外聚集体，称为老年斑(senile plaque)，同时神经元细胞减少。另外，在患者的脑血管中发现了一种名为类淀粉小体(amyloid body)的聚集体。

47. 遗传疾病的其它转基因小鼠模型 • 除了像老年性痴呆症这样的特殊遗传疾病以外，人们还建立了大量一般性遗传疾病的转基因小鼠模型，如I型糖尿病模型——NOD小鼠、X染色体连锁杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)模型——mdx小鼠、β地中海贫血症模型——β地中海贫血小鼠等。这些模型都成功地模拟了人类疾病的表现和发病机理，为相应的人的疾病的研究和治疗提供了有力的依据。 • 唐氏综合症是一种由于人的2l号染色体三体而造成的遗传疾病，使用目前的技术手段还难以将全长的染色体转入模型鼠，因此现在人们建立的部分三体转基因鼠模型实际上是将21号染色体上的铜锌超氧化物歧化酶(Cu／Zn—SOD)基因转入鼠体内而建成的。结果人们发现转基因鼠脑中的Cu／Zn—SOD活性增加了1.6—6倍，鼠的肌肉接头发生了类似过度老化的变化，并且伴有肌肉萎缩、变性、退化和末端轴突的破坏，巨线粒体、脂肪滴及脂褐质体的增加等唐氏综合症的症状。

48. 遗传疾病的其它转基因小鼠模型(续) • II型成骨不全症(osteogenesis imperfecta type II)患者的胞外基质发育不正常，往往是胎儿未出生就死亡或是新生儿夭折。造成胞外基质发育异常的主要原因是患者体内形成了异常的I型胶原。 • 正常的I型胶原是由两条αl(I)链和一条α1(II)链组成的三股螺旋，而成骨不全症患者的α1(1)链上发生了突变，导致无法形成正常的I型胶原。有人将人的编码突变的α1(1)链的基因通过微注射法转入小鼠后，发现转基因小鼠在出生前后即全部死亡。 • 进一步的研究表明，由突变的α1(I)链基因编码的αl(1)链蛋白只占形成I型胶原的前体α1(1)链的10％，但是在这些天折的转基因鼠体内异常的I型胶原却占全部I型胶原的54％。 • 由此，科学家们推测，异常I型胶原不仅会干扰正常的胞外基质的形成，而且可能会促进正常I型胶原的降解，导致正常构象的I型胶原在体内急剧减少，这就使人们对于成骨不全症的发病机制有了更进一步的了解。

49. 遗传疾病的其它转基因小鼠模型(续) • 人们还建立了另一种常在童年发病的遗传疾病——视网膜细胞瘤的转基因动物模型。在这个模型中，转入基因是黄体生成素(luteinizing hormone)β亚基的启动子驱动的SV40病毒的大T抗原。 • 人们观察到，在5个月之后，转基因鼠开始出现视网膜母细胞瘤，在转基因鼠中肿瘤的发生机制与在人体内的发生机制并不相同；对于人的视网膜母细胞瘤的研究表明，人的视网膜母细胞瘤是由于两个视网膜细胞瘤敏感基因均发生突变而造成的，但是在转基因鼠中，这两个敏感基因并未突变。 • 后来人们发现，转入基因中的SV40病毒的大T抗原可以与视网膜母细胞瘤敏感基因编码的蛋白p105Rb相结合，从而大大降低了p105Rb在细胞中的水平，导致视网膜母细胞瘤。尽管如此，由于在转基因鼠中肿瘤的症状与在人类中十分相似，这一模型仍可用来研究肿瘤的发展和转移特性。

50. 遗传疾病的其它转基因小鼠模型(续) • 由于鼠和人在代谢途径上存在一定的差异，所以有时同样的突变可能导致不同的症状。例如人类的自毁容貌综合症(Lesch-Nyhan syndrome)是由于位于X染色体上的编码次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphori-bosyl transferase，HGPRT)的基因发生了突变，导致HGPRT失活。HGPRT失活造成次黄嘌呤合成和鸟嘌呤合成的补救途径被阻。 • 顾名思义，自毁容貌综合症患者的主要症状是思维障碍和行为怪异，患者常常自残肢体。但是HGPRT基因缺失的鼠其行为完全正常，究其原因是由于鼠类能够利用尿酸氧化酶(urate oxidase)来代替HGPRT完成次黄漂吟和鸟漂吟的补救途径。只有先将尿酸氧化酶基因缺失，再引入突变的HGPRT基因，才能得到具有与人的症状类似的鼠模型。 • 随着人类基因组计划研究的日益深入，关于人类自身遗传信息的知识变得越来越多，相信不久的将来会有更多的人类疾病转基因动物模型问世。