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单元（扩充） 繁殖生物技术 Bio-Tec of Reproduction. 第一节 体外受精 第二节 发情控制 第三节 其它繁殖生物学技术. 第一节 体外受精. 体外受精是指卵母细胞与精子在体外融合，形成合子的过程。体外受精成功的标志是通过移植产生后代。 卵母细胞：体内；体外 精子：体外获能 一、卵母细胞 1、体内成熟卵母细胞 1）超数排卵：（略，胚胎移植讲） 2）卵母细胞采集 ：在内窥镜的导引下，穿刺成熟卵 泡，从卵泡中抽吸卵泡液和成熟卵母细胞。
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单元（扩充） 繁殖生物技术 Bio-Tec of Reproduction • 第一节 体外受精 • 第二节 发情控制 • 第三节 其它繁殖生物学技术
第一节 体外受精 体外受精是指卵母细胞与精子在体外融合，形成合子的过程。体外受精成功的标志是通过移植产生后代。 卵母细胞：体内；体外 精子：体外获能 • 一、卵母细胞 • 1、体内成熟卵母细胞 1）超数排卵：（略，胚胎移植讲） 2）卵母细胞采集 ：在内窥镜的导引下，穿刺成熟卵 泡，从卵泡中抽吸卵泡液和成熟卵母细胞。 3）镜检：将吸取的卵泡液及卵母细胞置于评皿中，在 体视显微镜下（25X）， 选则合格的卵母细胞，用 于体外受精。
合格卵母细胞标准：放射 冠细胞扩散良好，质地均 一，放射冠细胞间透明； 透明带清晰；卵母细胞圆 形，直径大小适中，细胞 质质地均匀，色泽柔和， 透明度适中（图－1）。 • 2、体外成熟的卵母细胞 • 1）卵母细胞来源 • （1）卵巢来源：从屠宰 场宰杀的母畜获得卵巢， 38 °C生理盐水中保温， 宰杀后 2 小时内运回实 验室。 图－1 成熟卵母细胞图
（2）采集卵母细胞－卵丘细胞复合物：用 38 °C 生理盐水洗涤卵巢 2 次，左手持卵巢，右手持注射器，如图所示，抽取 3－5mm 卵泡 的卵泡液及卵母细 胞－卵丘细胞复合 物，置于20ml试管 内，静置待检。 选择 3－5 mm 卵泡的原因是：更 大卵泡的闭锁比例 可能例高，更小卵 泡的发育程度可能 低。 图－2 卵母细胞－卵丘细胞复合物采集 示意图
生理盐水配方：NaCl 18g，Mill-Q（或三蒸水）2l， 青霉素2,000,000IU，链霉素2g。 • （3）镜检卵母细胞－卵丘复合物：用吸管吸取经静置 后试管底部的混合物于平皿中，用吸管铺平，在实体显微镜下用吸管检出卵母细胞－卵丘复合物，置于另一平皿中，用洗涤液在实体显微镜下洗涤2次，在洗涤过程中要剔除不合格的卵母细胞－卵丘复合物。选择合格的卵母细胞－卵丘复合物非常重要，否则将降低卵母细胞的成熟比例。 • 卵母细胞－卵丘复合物分类标准 a、分类依据：卵母细胞的直径、形状、质地的均匀度、色泽；透明带的完整性；卵丘细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程度、色泽。 一般分为4级，1、2级为合格；3、4级为不合格。
一级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。一级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密、完整， 质地均匀。 二级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密，但不完 整，质地均匀。 三级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地均 匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、 不完整，质地均匀。 四级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地不 均匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、 不完整，质地不均匀。
（4）卵母细胞－卵丘复合物体外成熟 体外成熟大多采取液滴或试管培养。液滴培养的 优点是培养液不蒸发，渗透压稳定，缺点是培养液中 的脂溶性物质能溶于覆盖的石蜡油；试管培养的缺点是培养液容易蒸发而致渗透压提高。一般来说，采用液滴培养普遍，因此，这里介绍液滴培养。 • a、制作体外成熟培养液滴 在一次性利用的平皿（3－6cm）中，用加样器整 齐、小心地加入液滴（大多采用50μl液滴），然后用 石蜡油覆盖，在CO2培养箱中平衡2小时（图－3）。 • b、培养 牛：在平衡后的每个液滴中用吸管加入5－10个卵母细胞－卵丘复合物， 39 °C 、5％ CO2、湿润环境中培养24小时，卵母细胞成熟，细胞核达到第二次减数分裂。
猪：在平衡后的每个液滴 中用吸管加入 5－10 个卵 母细胞－卵丘复合物，在 39 °C 、5％ CO2、湿润环 境中培养40－48小时，卵 母细胞成熟，细胞核达到 第二次减数分裂。 c、 成熟卵母细胞的检查 外观检查：卵母细胞在成熟过程中，卵丘细胞扩散，因此，卵丘细胞扩散，说明卵母细胞可能成熟（图－4）。 卵母细胞核成熟：在卵母 图－3 液滴示意图
细胞成熟过程中，卵母细胞启动第一次减数分裂，依据其核型进行鉴定。在成熟过程中，核型可分为核膜期、染色质浓缩期、核膜消失期、第一次减数分裂中期、第一次减数分裂后期、第二次减数分裂中期。各期特点如下（图－5）：细胞成熟过程中，卵母细胞启动第一次减数分裂，依据其核型进行鉴定。在成熟过程中，核型可分为核膜期、染色质浓缩期、核膜消失期、第一次减数分裂中期、第一次减数分裂后期、第二次减数分裂中期。各期特点如下（图－5）： 核膜期：经染色后可见完整的核膜。 染色质浓缩期：染色质染色很深、均一，此为卵 母细胞已经启动第一次减数分裂。 核膜消失期：核膜从断续到完全消失。 第一次减数分裂中期：染色体分为两组。此时标 志着卵母细胞核已经成熟。 第二次减数分裂中期：染色体分为两组，可见第 一极体。 卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因此，通常 只检查细胞核的成熟。
卵母细胞核染色（图－6） 制片：压片。 固定：固定液 乙醇：乙酸＝3：1，24h 染色：1％地衣红，40％乙酸 镜检：光学显微镜
图－6 制片、固定、染色 示意图
二、精子体外获能 • 1、牛冷冻精液：Swimming-up • 2、猪精液：高Ca离子孵化 • 3、绵羊精液：肝素＋羊血清孵育法 • 三、体外受精 • 1、制备体外受精液滴：35＋15 μl液滴 • 2、体外受精：10卵子，加获能精子至106精子/ml • 3、培养：5%CO2 ，38 °C培养12小时。
