Biochemická diagnostika genetických porúch

1. E-1 E-2 FYZIOLOGICKÝ METABOLIT SUBSTRÁT PATOLOGICKÝ METABOLIT NÍZKO TOXICKÉ ODPADOVÉ LÁTKY ATP ENERGETICKÝ METABOLIZMUS SUBSTRÁT SUBSTRÁT CHARAKTERIZÁCIA Diagnostika prebieha na úrovni metabolitov, enzýmov a proteínov. Je základným prístupom pri odhalení dedičných metabolických porúch (DMP), ktoré sú spôsobené mutáciou génov a rezultujúcim funkčným deficitom enzýmov, transportných proteínov a receptorov. Tam kde je potrebné pristúpiť k biopsiám tkanív, uprednostňujú sa v prípade dostupnosti molekulárno-genetická diagnostika. Nie vždy je však táto alternatíva metodicky a ekonomicky schodná. V mnohých prípadoch určenie diagnózy DMP vyžaduje vykonanie in vivo funkčných testov a monitorovanie zmien v hladinách metabolitov. INCIDENCIA A DEDIČNOSŤ DMP Celkový výskyt v zmiešanej populácii sa odhaduje až na 0,2% a  frekvencia jednotlivých chorôb býva 1: 200000 až 1: 5000. V SR je častý výskyt cystickej fibrózy, fenylketonúrie, alkaptonúrie, kongenitálnej adrenálnej hyperplazie (CAH), deficitu dehydrogenázy pre stredne dlhé reťazce (MCAD), X-viazanej adrenoleukodystrofie a deficitu myoadenylátdeaminázy (AMPD). Až u 90% DMP je dedičnosť autozómovo-recesívna, u 5% viazaná na X-chromozóm, u 2% mitochondriálna-maternálna a u 2-3% autozómovo-dominantná. VYUŽITIE CHROMATOGRAFICKÝCHMETÓD A ICH KOMBINÁCIE S HMOTNOSTNOU SPEKTROMETRIOU V DIAGNOSTIKE DMP HPLC-vysokoúčinná kvapalinová chromatografia: Uplatňuje sa zvlášť vtedy, keď nemožno použiť plynovú chromatografiu pre nízku prchavosť, tepelnú nestabilitu alebo nevyhovujúcu separáciu metabolitov. Stacionárnu fázu predstavujú častice adsorbentu (silikagél, ionexy, reverzné fázy), ktorými je naplnená krátka kolóna. Mobilná fáza je pretláčaná cez kolónu pomocou účinných vysokotlakových čerpadiel. Zariadenie obsahuje dávkovač vzorky a rôzne typy detektorov – UV fotometrický, fluorescenčný, elektrochemický a podobne. Separačná metóda sa uplatňuje pri analýze aminokyselín, purínov, pyrimidínov a porfirínov. GC-plynová chromatografia: predstavuje rutinnú a veľmi účinnú separačnú metódu pre tie metabolity, ktoré možno bez porušenie ich štruktúry dostať do plynného stavu. Ide o fyzikálnu metódu separácie metabolitov (moča, séra, plodovej vody) medzi mobilnú a stacionárnu fázu. Ako nosný plyn sa využíva vodík alebo hélium, zvlášť pri spriahnutí s hmotnostnou spektrometriou. Rozdeľovanie látok prebieha v kapilárnych kolónach 25 až 50m dlhých, s vnútorným priemerom 0,1 – 0,3 mm umiestnených v pieckach s programovateľnou teplotou. Postupný vzrast teploty umožňuje dosiahnutie plynného stavu látok a ich separáciu pri vysokom tlaku nosného plynu. Každé takéto zariadenie obsahuje injektor vzorky, rôzne typy detektorov (plameňový, ionizačný), avšak v diagnostike DMP je bezkonkurenčný hmotnostný detektor, ktorý umožňuje zachytenie hmotnostných spektier delených látok. Metóda sa uplatňuje pri analýze organických kyselín, mastných kyselín, cholesterolu a jeho derivátov, steroidných hormónov, aminokyselín a acylkarnitínov. MS-hmotnostná spektrometria: Ide o metódu identifikácie metabolitov na základe zistenia hmotnosti iónov a ich zastúpenia v spektre, ktoré vzniká fragmentáciou (štiepením) organických molekúl. Štiepenie molekúl sa dosiahne pri ich zrážke s elektrónmi (emitujú sa žeravením katódy) s dostatočnou energiou v  ionizačnej komôrke. Hmotnostné spektrum je pri definovaných podmienkach pre metabolit charakteristické. Okrem iónových fragmentov sú v zázname často prítomné molekulové ióny, ktoré sú taktiež cenné pre zhodnotenie typu a množstva prítomného metabolitu. Zariadenie obsahuje analyzátorovú časť (kvadrupól, iónová pasca), ktorá má schopnosť rozdeliť ióny a detektor. Na vyhodnotenie záznamu a identifikáciu molekúl slúži rozsiahly softvérový program s knižnicami spektier obsahujúcich niekoľko tisíc látok. Identifikáciu metabolitov a diagnózu DMP však robí erudovaný pracovník, vďaka syntéze mnohých údajov nadobudnutých dlhodobou skúsenosťou. Údaje o klinickom stave pacienta a zmene iných vyšetrovaných parametrov sú nepostrádateľné pre vyslovenie definitívnej diagnózy. Nakoľko DMP sa často vyznačujú veľkou variabilitou vo fenotypových prejavoch (klinický stav i laboratórny nález) nezriedka sa diagnóza určí až pri opakovanom vyšetrení. Biochemická diagnostika genetických porúch ROZDELENIE DMP Podľa metabolických celkov na poruchy: metabolizmu, transportu AMK a detoxikácie amoniaku; metabolizmu a transportu sacharidov; metabolizmu lipoproteínov; transportu, oxidácie karboxylových kyselín a ketogenézy; metabolizmu nukleotidov; metabolizmu porfirínov; metabolizmu vitamínov; metabolizmu minerálov; metabolizmu neurotransmiterov; syntézy izoprénov, sterolov, plazmalogénov a glykoproteínov. Podľa kompartmentu na poruchy: mitochondriové, lyzozómové, peroxizómové , Golgiho aparátu PREČO A AKO SA DMP MANIFESTUJÚ Hromadenie metabolitov pred defektom vedie k využitiu alternatívnych metabolických ciest a k tvorbe toxických látok a inhibítorov (napríklad sukcinylacetón, metylmalonát). Často sa zníži využitie alebo tvorba energeticky významných substrátov (glukóza, galaktóza, glykogén, mastné kyseliny, ketolátky, AMK), nastáva deplécia alternatívnych substrátov a dostaví sa rozvrat vnútorného prostredia. V iných prípadoch zlyhajú významné detoxikačné cesty (syntéza močoviny, konjugovaného bilirubínu) a vzrastu niekoľkonásobne hladiny toxických látok. V bunkách svalov a vnútorných orgánov môže dôjsť k hromadeniu biopolymérov, ktoré narušia fyziologické bunkové funkcie (lyzozómové tesaurizmózy). Iný typ porúch je podmienený nedostatočnou syntézou funkčne významných molekúl ako sú cholesterol, žlčové kyseliny, plazmalogény a steroidné hormóny. Klinická manifestácia môže zahŕňať ťažké multiorgánové poškodenie a zlyhanie, poškodenie jednotlivých orgánov (encefalopatie, hepatopatie, myopatie, kardiomyopatie, tubulárne poruchy), kómu, rozvrat vnútorného prostredia, malformácie, stigmatizácie, psychomotorickú retardáciu, kŕče, neurologické a psychické poruchy, senzorické poruchy, GIT poruchy a časté infekcie. Najčastejšie situácie v dedičných poruchách metabolizmu sú znázornené na schéme. Mnoho DMP sa prejavuje zmenami v profile organických kyselín a ich derivátov. Tak ako je to znázornené na obrázku, organické kyseliny vznikajú pri metabolizme veľmi širokej škály látok. Vo vzorke moča analyzovanej metódou GC/MS bežne pozorujeme prítomnosť 100 až 200 metabolitov. GC/MS analýza nám umožňuje na základe retenčných časov a hmotnosných spektier identifikovať neznámu látku (A.: v zázname vľavo je kyselina fumarová, vpravo je kyselina suberová). K tomuto účelu slúži aj monitorovanie dvoch iónov, ktoré sú pre danú látku charakteristické a v niektorých prípadoch aj monitorovanie molekulového iónu (B.: v zázname Q, C, M+- m/z). Spektrá analyzovanej látky porovnávame s databázou knižníc spektier a vyberáme z ponúk látku, ktorá môže zodpovedať danému metabolitu (C.: viď ponuku). AKÉ BIOCHEMICKÉ METÓDY SA V DIAGNOSTIKE DMP VYUŽÍVAJÚ V SR je celopopulačný skríningový program pre záchyt fenylketonúrie, kongenitálnej adernálnej hyperplázii -CAH a kongenitálnej hypotyreózy. V diagnostike DMP sa využijú aj rutinné biochemické vyšetrenia, ktoré však spravidla nie sú postačujúce na určenie diagnózy. Niektoré ochorenia možno zachytiť aplikáciou jednoduchých orientačných vyšetrení moča, ktoré poukážu na zvýšený odpad metabolitu ako napríklad kyseliny homogentisovej alebo skupiny látok – sacharidov, disulfidov, mukopolysacharidov. Významnú diagnostickú hodnotu môžu mať aj tenkovrstvové chromatografie (TLC). Vo väčšine prípadov ja však nevyhnutná aplikácia špeciálnych analytických metód, ktoré umožnia zachytenie a identifikáciu zvýšeného množstva metabolitov, respektíve prítomnosť aj malých množstiev patologických metabolitov. Výhodou týchto analytických prístupov je, že umožňujú identifikáciu širokej škály metabolitov s analogickými fyzikálno-chemickými vlastnosťami (aminokyseliny, mastné kyseliny, organické kyseliny, puríny a podobne). Medzi tieto metódy patrí vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC), plynová chromatografia (GC), hmotnostná spektrometria (MS), ktorá môže byť spriahnutá so separačnou metódou LC alebo GC. V poslednom období sa v metabolomike, či už v populačných skríningových programoch alebo pri selektívnom záchyte a identifikácii metabolitov využíva tzv. tandemová hmotnostná spektrometria (MS/MS) a elektrosprayová ionizačná hmotnostná spektrometria (ESI/MS). Prevaha metabolických ochorení je podmienená deficitom enzýmových aktivít. Vyšetrenie aktivít enzýmov, ktoré sú prítomné v dobre dostupnom biologickom materiály - v leukocytoch, amniocytoch, erytrocytoch patrí v diagnostike DMP taktiež medzi bežné vyšetrenia. A. B. C.