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第二节 基因工程研究 • 第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”， 标志着基因工程技术的诞生。
（基因工程技术包括下列过程） 分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选 鉴—重组DNA的鉴定 可用以上五个字表示
（一）目的基因的分离（分） 目的基因：是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略 一般分离基因的策略要满足以下几个基本特性中的至少一个： （1）具有特定的核苷酸序列；（2）存在于基因组中某一特定位置；（3）编码mRNA；（4）大多具有一定的功能。
2、基因分离的注意事项 （1）以基因表达产物蛋白质的纯化或表型突变体的分离； （2）通过植物细胞工程、物理和化学诱变等技术，获得植物基因； （3）可在cDNA文库中随机取一个克隆； （5）采用染色体步移(chromosomal walking)方法分离基因出来； （6）许多植物基因可以根据其与细菌和酵母突变互补能力来分离； （7）许多有潜在利用价值的植物基因。
需要克隆的DNA片段 cDNA文库 基因组DNA文库 化学合成法 聚合酶链式反应 （二）目的基因的制备 化学合成方法 制备方法 生物制备法
1）化学合成法 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于合成小分子多肽的基因 全基因合成：合成40-60bp片段，再连接 合成思路 基因的半合成：合成末端间有10-14bp个互补碱基的 片段，再利用DNA聚合酶催化合成 目前，常用DNA自动合成仪合成。
化学合成思路模式图 连接 目的基因全长 重叠区 合成目的基因的引物 重叠区 用途： PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针
2、基因组文库（Genomic DNA Library） 基因组文库(gene library)：是指汇集某一基因组所有DNA序列的重组DNA群体 从生物组织细胞提取出基因组DNA，用限制性酶法将DNA降解成预期大小的片段，并电泳分离，然后将这些片段与适当的载体（噬菌体）体外重组，进行体外包装系统将重组体包装成完整颗粒，转入受体细菌（大肠杆菌），形成大量噬菌斑，从而形成整个基因组DNA的重组DNA克隆群体，称为基因组DNA文库。 具备了基因组文库，就可以用目的基因片段作探针，利用菌落原位杂交技术，从大量的菌落中筛选出含有目的基因的重组体的菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。
基因组DNA文库法示意图 Genome DNA Digest with restriction enzyme DNA recombination Packaging and assembly Transformation Genome DNA
3、cDNA文库法 cDNA文库(cDNA library)：是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体 操作流程：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体，常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合就形成了该组织细胞的cDNA文库。 实际为不包含内含子的基因组文库。
分离目的基因 的mRNA 逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA， 合成cDNA双链 水解回折处单链 得到平端双链cDNA 导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库
引物 基因组 5’ 5’ 3’ 5’ 引物 （三）聚合酶链反应( PCR) 在模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶等条件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因
二、 目的基因与载体的重组（接） （一）质粒DNA的分离和纯化 （二）目的基因与载体的连接 1、粘性末端连接 2、平头末端连接 3、人工接头法 4、同源多聚尾连接法
（一）质粒DNA的分离和纯化 载体的本质是DNA，所以其分离纯化类似于DNA的分离纯化 纯化步骤： 质粒载体宿主菌 释放出质粒DNA、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA等细胞内大分子 DNA 除去蛋白 质粒DNA 与核内环性和线性DNA分开 溶菌酶 离心 酚 EB，CsCl 离心
（二）目的基因与载体的连接 1、粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 2、平头末端连接 某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。
基因和载体用同一种限制酶酶切（粘性末端连接）基因和载体用同一种限制酶酶切（粘性末端连接）
3、人工接头法 人工接头是合成的寡核苷酸，在其上人为地安置了限制性内切酶的识别序列。将人工接头连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。
4、同源多聚尾连接法 也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。
三、将重组体导入受体细胞 (转) 根据受体生物，可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法 (一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞（Competent Cell）的制备：用特殊方法处理，使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程：感受态细胞和重组DNA混合，使DNA与钙离子形成复合物，吸附于细胞表面，经42℃短暂（90s）的热处理，促进外源DNA进入感受态细胞。
50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 • 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； • 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； • 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作； • 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
几个概念： • 狭义的转化(transformation)是感受态的大肠杆菌细胞接受及表达质粒DNA分子的生命过程——氯化钙转化法； • 转染(transfection)是感受态的大肠杆菌细胞接受及表达噬菌体DNA分子的生命过程。 狭义的转化得到的是转化子菌落；而转染得到的是噬菌斑 • 广义的转化是指将外源DNA引入受体生物细胞的过程。
2、转导(transduction) 将重组的λ噬菌体DNA或柯斯质粒DNA体外包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒，然后经受体细胞表面的λ噬菌体接受器位点使这些重组体DNA注人大肠杆菌宿主细胞。 转染的效率较低，在基因工程中，λ噬菌体DNA等的直接转染并不常用。因此，常用λDNA体外包装技术。即首先将λ噬菌体DNA或柯斯质粒DNA体外包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒，然后再以其转导受体细胞
基因重组 噬菌体 体外包装 转导 噬菌体体外包装
λ噬菌体体外包装的基本原理： λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来就能在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。 一般只要为重组DNA提供高浓度的噬菌体前体，包括包装蛋白、头部、尾部，就有可能形成完整的噬菌体颗粒。 λ噬菌体头部外壳蛋白包装DNA的容量控制在野生型λDNA长度的75％一105％。
(二) 酵母转化法 1、完整细胞转化法 首先利用乙酸锂或氯化锂处理对数生长期的酵母细胞，然后在运载DNA(鲑精DNA、小牛胸腺DNA)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和聚乙二醇存在下，重组DNA经热冲击进入酵母细胞 在转化过程中，PEG（聚乙二醇）的作用非常重要，因为PEG能将大分子DNA沉积于受体细胞表面
2、原生质体转化法 酵母细胞经过用适当水解酶酶解消化细胞壁等处理后，也像大肠杆菌一样能够接受外源DNA重组体的导入。 操作方法： 该法首先利用蜗牛酶处理对数生长期的酵母细胞，然后将经酶解去除了细胞壁的原生质体悬浮于山梨醇及氯化钙的溶液中，在运载DNA的存在下，用聚乙二醇使重组DNA分子进入酵母细胞。
(三) 植物细胞转化法 1、农杆菌质粒介导法 • 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。 • 它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。 • 迄今所获得的近200种转基因植株中80％以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。
一般流程如下： 根癌农杆菌的培养、纯化→根癌农杆菌工程菌侵染液的制备→植物外植体的预培养→将根癌农杆菌工程菌接种到植物外植体的损伤切面→植物外植体与根癌农杆菌的共培养→植物外植体的脱菌培养→转化体的选择培养。
挑单克隆进行 培养、纯化
工程菌 预培养的植物外植体 将预培养的外植体放入菌液中共培养
在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化， 形成转化芽（脱菌培养）
2、基因枪法 基因枪法首先将外源DNA黏附在微小的金粒或钨粒的表面，然后在高压的作用下，将微粒高速射入受体细胞或组织，使微粒上的外源DNA进入受体细胞，整合于染色体上 基因枪转化的操作步骤： • 金粒、钨粒的处理 • 微粒子弹的制备（外源DNA-金粒或钨粒复合体的制备 ） • 装备基因枪 • 靶细胞或组织的预处理 • DNA-金粒或钨粒复合体轰击 • 轰击材料的过渡培养 • 进行筛选培养或直接分化再生植株
便携式基因枪 台式基因枪
基因枪法转化的优点有： 无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速 缺点： 转化率低，外源DNA整合机理不清楚。应该说该技术只处在研究阶段，尚未成熟。
1、显微注射法 显微注射法首先利用非常微细的玻璃毛细管携带外源DNA，在显微镜下直接将外源DNA注射到动物受精卵细胞核中，然后将导入外源DNA的受精卵经体外培养、检测后作胚胎移植 Microinjection
Microinjection 的主要特点如下： ① 体外受精。从受体动物的卵巢里获得卵母细胞，体外孵育成熟，加入精子，进行体外受精，并进行受精卵的体外培养； ② 在胚胎移植前检测、鉴定外源DNA的整合，可定向挑选具有目的基因整合的胚胎进行移植； ③ 改进胚胎移植技术可以减少受精卵的损伤，提高受精率。 First cloned cat
2、磷酸钙共沉淀法 磷酸钙共沉淀法首先将一定浓度的氯化钙和外源DNA置于含有靶细胞的磷酸缓冲液中，然后调节pH使外源DNA与钙结合形成白色的共沉淀。这些白色沉淀可沉积于靶细胞细胞膜的表面，阻断溶酶体酶的活性，改善细胞膜的通透性，并诱导细胞吞噬，从而使外源DNA进入靶细胞。 该法适于多种细胞，并可形成稳定的转化子
