植物蛋白质的提取和含量测定

1. 植物蛋白质的提取和含量测定

2. 一、实验目的 掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白丙酮干粉的方法。

3. 二、实验原理 • 大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI 4.5-5.0，能溶于碱溶液 • 本实验先利用稀碱提取大豆蛋白，再利用丙酮结合等电点溶解度最低原理沉淀蛋白。 • 2. Folin-酚法测定蛋白质含量 • 酚试剂由两部分组成，试剂A为双缩脲试剂，可与肽链发生显色反应，试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在OH-条件下不稳定，易被酚类化合物还原显蓝色，因蛋白质中含Tyr被还原成蓝色，颜色深浅与浓度成正比，可用比色法测定。

4. 三、实验器材 • 分光光度计（500nm），比色皿 • 计算纸（9 cm×9 cm） • 离心机 （离心管100ml 、50ml） • 组织捣碎机 • 精密pH试纸pH 0.5-5.0; pH 4.5-7.0

5. 四、实验试剂 1.大豆干粉 2. 0.2%NaOH 3. 丙酮 （预冷） 4. 6M HCl，1M HCl 5 标准 BSA（0.5 mg/ml） 6. Folin—酚试剂甲（用前组分一: 组分二 = 50:1） （1） 1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。 （2） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解100毫升 1%酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6•4H2O）中。 每次使用前，将50ml（1）与1ml（2）混合，即为试剂甲。

6. 四、实验试剂 7. Folin—酚试剂乙 （用前稀释一倍） 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。

7. 五、实验步骤 （一）蛋白提取 1.称取3克大豆干粉，加入0.2%NaOH 30毫升。（先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min，于4000r/min离心7min ,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物，再经过滤； 2. 留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步） 3.制干粉： 量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L的HCl调pH至6.0，再用1mol/L的HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min，(留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉，用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束后，再称重并计算产率（即3克大豆干粉中蛋白含量）。

8. 五、实验步骤 （二）蛋白含量测定 1. 制作标准曲线 按照下表操作，以A500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。 2. 测定提取第2步稀释后样品的蛋白浓度 按上表中样品列操作，根据A500nm查找含量，并计算原始浓度。