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2. 细菌学诊断法

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2. 细菌学诊断法

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  1. 2. 细菌学诊断法 • 是发现牛结核传染源的重要手段和途径,主要包括细菌涂片镜检、细菌培养试验: • 细菌涂片镜检:材料、设备简单,操作方法简便;特异性较差、易出现假阴性 • 细菌培养试验:周期长,易受杂菌污染 • 一般只作为牛结核病诊断的辅助方法。

  2. 相关工作 结核菌培养及片段扩增

  3. 牛PBMC细胞形态检测结果

  4. 肺泡巨噬细胞抗酸染色结果 • 结果显示,有牛分枝杆菌侵入的肺泡巨噬细胞比例为7.9%,胞内出现5个以内牛分枝杆菌的肺泡巨噬细胞比例为5.8%,出现5-10个的占4.6%,出现10个以上的占1.2%。

  5. 3. 免疫学诊断法 • 是牛结核诊断方法中应用最广泛,也是目前国内外研究最多的一类方法。 • 主要包括:迟发型变态反应、酶联免疫吸附试验( ELISA)、γ-干扰素试验、免疫层析法(免疫胶体金技术)等。

  6. 免疫学诊断法 1.迟发型变态反应法 目前临床上应用最广泛的方法,也是国际规定测定牛结核病的标准方法。主要通过两种途径:皮内(为主)和点眼(为辅)。 • 优点:方法简单,操作容易,且检出率较高 • 缺点:①特异性较差(禽分支、BCG);②滞后效应; • ③只能用于活体;④假阴性(病情严重) • 需要找出一种特异性较高的诊断方法取代 或者辅助该方法的诊断。 结核菌素点眼检查

  7. 免疫学诊断法 2.酶联免疫吸附试验( ELISA) • 优点:①操作简单,价格低廉,诊断快速 ②对检出重症结核病牛有特殊作用 ③可降低非典型分枝杆菌非特异性干扰 ④可避免皮试检测时人为造假影响 • ⑤方便对野生动物进行结核病的普查 • 用于ELISA的主要诊断抗原:PPD、CFP-10、ESAT-6、MPB70、MPB83、Mce4E、RpfC。使用不同抗原的ELISA,其检测的特异性和敏感性不同。 • 将两种或者两种以上特异性抗原融合蛋白作为牛结核病诊断抗原,在保持高特异性的基础上能大大提高ELISA检测牛结核的敏感性。 • Aagaard等使用不同诊断抗原对不同地区的不同牛群检测发现,ESAT-6与CFP-10联合使用在敏感性和特异性上都优于单独使用任一抗原。

  8. 免疫学诊断法 迟发型变态反应法与 ELISA诊断法的比较分析 • ELISA与迟发型变态反应相辅相成。在当前实际检疫工作中,采用迟发型变态反应和ELISA相结合的方法进行结核病诊断,既有助于提高结核检疫的特异性,又可以大大提高阳性牛的检出率(细胞免疫和体液免疫均可检测)

  9. 免疫学诊断法 3. γ-干扰素诊断法 • 原理:致敏的外周血淋巴细胞(PBL)在体外培养的条件下,受特异抗原(如PPD或ESAT-6)刺激后被活化,并经16-24小时的孵育表达并分泌γ-干扰素,通过一定的技术手段(ELISA)对培养上清中的γ-干扰素进行检测。 • 目前,IFN-γ检测方法在许多国家推广使用,且已有检测试剂盒出售。

  10. 免疫学诊断法 3. γ-干扰素诊断方法

  11. 结 果牛结核PPD检疫及IFN-γ试剂盒检测结果

  12. 利用建立的牛γ-干扰素双抗体夹心ELISA 技术,建立牛结核γ-干扰素检测方法。 • 这种方法既可以作为特异性强的早期诊断方法,还可以作为自然感染与BCG免疫的鉴别诊断方法,从而为高危牛群接种疫苗免疫的可能性奠定技术基础。

  13. 免疫学诊断法 4. 免疫胶体金技术 判断标准: • 阴性结果:在试纸条上只出现一条紫红色的条带(对照带)(图 A) • 阳性结果:试纸条上出现两条紫红色的条带(检测带和对照带)(图 B) • 无效结果:在胶体金试纸条的对照带处不出现紫红色的条带(图 C) A B C 免疫胶体金结果示意图

  14. 免疫学诊断法 γ-干扰素诊断法、免疫胶体金技术、PCR诊断法的优缺点分析 • 三种方法都有简便快速,特异性强、敏感性高等优点,有很好的应用前景,但技术还不够成熟,试剂盒缺乏规范化、标准化,还需要对这些技术做进一步的研究和完善,并加快试剂盒的研制。

  15. 4. 分子生物学检测 • 4.1 牛分枝杆菌基因片段扩增 • 4.2 特异性重组蛋白表达分析 • 4.3 结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复合群成员的鉴定

  16. 4.1 牛分枝杆菌基因片段扩增 1 M 2000 bp 582bp 1000 bp 750 bp 500 bp 200 bp 100 bp 利用分子克隆技术,以牛结核分支杆菌标准菌株全基因组为模板体外扩增基因。 600bp MPB70基因的PCR扩增 MPB83基因的PCR扩增

  17. 牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的PCR分型鉴定结果 • M.tb、M.bovis占双阳性牛分离率分别为22.2%、55.6%;在检测牛中,M.tb、M.bovis的平均分离率分别为0.073 % 、0.19%。

  18. 结核菌基因多态性分析 图5.1 H37Rv 24个串联重复序列位点分布电泳图 M为100bpMarker,其余泳道从左到右依次为H37Rv中24个VNTR位点PCR产物的分布情况

  19. 结核菌基因多态性分析 图5.2 临床分离株FC 24个串联重复序列位点分布电泳图 M为100bpMarker,其余泳道从左到右依次为临床分离株FC中24个VNTR位点PCR产物的分布情况

  20. M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 结核菌基因多态性分析 对临床株基因组DNA样品进行VNTR的12个位点的扩增、琼脂糖电泳,电泳结果反应了临床株在各位点的特异性片段大小。 图5-8 某临床株12个VNTR位点扩增图谱,M为DL100的Marker,1-12所对应的位点以此为ETR-C、ETR-B、MIRU-26、QUB-26、Mtub04、MIRU-31、MIRU-23、MIRU-20、QUB-11b、MIRU-4、MIRU-40、Mtub21

  21. 4.2 特异性重组蛋白表达分析 M 1 2 3 97.4 kDa 66.2 kDa 43.0 kDa 31.0 kDa 20.1 kDa 利用基因重组技术表达牛结核分枝杆菌Mce4A、Mce4E蛋白和Rpf 蛋白,并对这三个蛋白进行Ni-NTA镍柱纯化、透析复性,在体外获得Mce4A、Mce4E蛋白和Rpf 蛋白。 29KD 26KD MPB70重组蛋白Western-Blot分析 MPB83重组蛋白Western-Blot分析

  22. 三、 牛结核的防控 • 1. 国外防控措施 • 2.我国防控现状

  23. 1.国外防控措施 消灭或控制牛结核病的国家和地区,大多采取检疫、隔离、扑杀相结合的防控策略。 国外也开展疫苗(主要用于动物)的研发工作。

  24. 澳大利亚从上世纪70年代正式开始牛结核的根除工作,现 已基本根除了牛结核。根除过程中使用的技术措施主要包括: • 对“无疫区”、“暂时无疫区”等地区状况和疑似、感染等畜群状况进行了规定,并制定了不同地区间的迁移标准; • 检疫过程中主要使用尾根皮肤试验和比较变态反应试验,官方兽医机构对未感染结核病的奶牛颁发合格证; • 建立完善的屠宰场检疫体系和动物标识追踪体系; • 完善的实验室工作,主要利用细菌培养验证检疫出来的阳性样品。

  25. 2.我国防控现状 目前主要采取检疫净化(检-淘)的措施。 2000-2007年全国动物结核病防治共检疫监测牛2123.3万头(次),其中奶牛1703.99万头(次),扑杀病畜4.9万头,其中奶牛4.7万头。 该防控措施的实施为牛结核病疫情的控制发挥了重要作用。 参加了北京市密云县的结核病牛净化工作。

  26. 具体实施方案 健康牛群:平时加强防疫、检疫和消毒措施,防止疾病传入。 污染牛群:反复进行多次检疫,不断出现阳性病畜,则应淘汰污染群的开放性病畜及生产性能不好、利用价值不高的结核菌素阳性反应病畜。

  27. 结核菌素反应阳性牛群: 应定期与经常地进行临诊检查,必要时进行细菌学检查,发现开放性病牛立即淘汰。 最好对结核菌素阳性牛及时处理,不予保留饲养,根绝传染源。 病牛所产犊牛出生后只吃3~5天初乳,以后则由检疫无病的母牛供养或喂消毒乳。 犊牛应在出生后1月龄、3~4月龄、6月龄进行3次检疫,凡呈阳性者必须淘汰处理。如果三次检疫都呈阴性反应,且无任何可疑临诊症状,可放入假定健康牛群中培育。

  28. 假定健康牛群:为向健康牛群过渡的畜群,应在第一年每隔3个月进行一次检疫,直到没有一头阳性牛出现为止。然后再在一年至一年半的时间内连续进行3次检疫。如果3次均为阴性反应即可称为健康牛群。假定健康牛群:为向健康牛群过渡的畜群,应在第一年每隔3个月进行一次检疫,直到没有一头阳性牛出现为止。然后再在一年至一年半的时间内连续进行3次检疫。如果3次均为阴性反应即可称为健康牛群。

  29. 防治人结核病的主要措施是早期发现,严格隔离,彻底治疗。牛乳应煮沸后饮用;婴儿普遍注射卡介苗。治疗人结核病有多种有效药物,以异烟肼、链霉素和对氨基水杨酸钠等最为常用。防治人结核病的主要措施是早期发现,严格隔离,彻底治疗。牛乳应煮沸后饮用;婴儿普遍注射卡介苗。治疗人结核病有多种有效药物,以异烟肼、链霉素和对氨基水杨酸钠等最为常用。

  30. 祝大家工作顺利!节日快乐! 谢谢大家!