硕士研究生开题报告

硕士研究生 开题报告

姜黄素对鼻咽癌细胞侵袭和转 移的影响机理及放射增敏研究 • 研究生范德生 • 导师孙宁教授 • 时间 2004 10

第一部分 • 立题依据

鼻咽癌的特点 1.发病 2. 病变及治疗特点 3 .鼻咽癌患者死亡原因总之，在华南地区研讨鼻咽癌的转移及放疗问题具有重要的意义

鼻咽癌转移 关于肿瘤的转移研究有“种子和土壤学说”、肿瘤的异质性等许多理论和学说。而细胞的运动能力则是肿瘤的侵袭和转移的先决条件

细胞骨架与细胞运动 一细胞骨架 1）微丝 2）微管 3) 中间纤维二细胞运动大概分三步，但具体机制尚不十分清楚。与肌动蛋白、肌球蛋白等的变化有关。

细胞骨架与肿瘤转移 • 有研究显示恶性程度不同肿瘤细胞的肌动蛋白微丝和微管骨架均有数量减少及发育不良，其完善程度与横纹肌肉瘤的转移潜能呈负相关，纤维状肌动蛋白（fibrous actin，F-actin）的出现频率与横纹肌肉瘤的转移潜能呈正相关，

细胞骨架与肿瘤转移 研究提示不同程度细胞骨架的异常可能与横纹肌肉瘤的转移潜能不同有关，微管持续解聚可能与细胞的高活动性、低粘附性和高转移性有一定联系。。

细胞骨架与肿瘤转移 • 有学者采用cDNA代表性差异分析法筛选鼻咽癌中不表达的或表达降低的cDNA序列，发现了与细胞骨架成分相关的基因。 • 提示鼻咽癌早期转移极有可能与细胞骨架相关的基因不表达或表达下调相关。

EGF、EGFR与肿瘤转移 表皮生长因子（EGF)是一种小分子多肽，EGF是由53个氨基酸构成的单链多肽,，分子量为6.45kD，内含三个双硫键，其生物学作用极其广泛,特别是上皮细胞的增殖有重要影响。表皮生长因子受体（EGFR）是EGF的唯一受体，其超表达与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。

EGF、EGFR与肿瘤转移 1）有研究证实细胞运动和迁移能力随EGF量的增加而增强 2）我教研室亦有试验证实随着NPC单克隆细胞的演进，移植瘤保持了高水平的淋巴结转移率，EGFR的表达亦增强 3)原因可能是EGF促进细胞DNA合成同时增加角蛋白、纤维蛋白和胶原蛋白的合成

EGF、EGFR与细胞骨架 1） EGF作为一种配体与细胞膜上的EGFR结合，改变受体的三维构象，使之二聚体化，进而可激活众多的下游信号路径 2）研究较明确的主要有两条途径：一条是ras-raf-MEK-erk/MAPK途径；另一条是PI3K-PKC-IKK途径。 3）以上途径使IJBA磷酸化后导致NFJB移位至核内，而将信息传递入核，该途径与细胞移动性的增强有关

EGF、EGFR与细胞骨架 • EGF与EGFR结合后，可以激活细胞骨架，通过对细胞骨架重构、粘附、移动、表达和蛋白酶的活化等多种作用，影响肿瘤的转移性 • actin修饰蛋白的动员是EGFR介导的迁移反应所必需的

EGF与电离辐射 • 研究证明电离辐射会导致肿瘤细胞EGFR应激性激活。

姜黄素概况 充分利用我国中医药资源姜黄(curcuma)是姜科植物的根茎，因其根茎盘屈呈黄色，形似生姜而故名姜黄素药理作用广泛，主要特性为抗炎和抗氧化。

姜黄素的抗肿瘤研究 • Kuttan等发现姜黄素明显抑制CHO(仓鼠卵巢)细胞的生长 • 后来试验陆续证实对其它肿瘤的抑制作用 • 体外细胞学实验发现，姜黄素对食管癌、胃癌、结肠癌细胞等具有直接杀伤作用

姜黄素抗肿瘤的机理 目前研究情况 ⑴　诱发肿瘤细胞凋亡 ⑵　抑制蛋白激酶C的活性 ⑶　降低转移率，抑制血管生成

姜黄素抗肿瘤的可能机理 Liu Squires的研究结果提示，姜黄素在与抑制增殖和诱导凋亡有关的MAPK和 PI3K信号传导通路中有多种不同的靶分子研究提示姜黄素在体外是通过与磷酯酰丝氨酸竞争来抑制PKC的活力

姜黄素抗鼻咽癌的机理 • 姜黄素具有较好的抗肿瘤活性，对正常生物体无毒、副作用 • 本室已完成的试验发现，姜黄素可抑制CNE-2Z细胞体外生长、及产生G2/M期阻滞。

姜黄素抗鼻咽癌的机理新探 • 是否通过抑制EGF/EGFR-PKC途径而改变肿瘤细胞骨架影响其侵袭转移能力 • 是否能通过细胞骨架的破坏对鼻咽癌细胞起直接杀伤的作用

姜黄素与辐射增敏 1）已有研究证明对多种肿瘤有增敏作用 2）对鼻咽癌细胞辐射增敏本室已有研究

姜黄素与辐射增敏 • 姜黄素抑制EGF/EGFR的PKC作用通路而EGFR具有较强辐射抗性 4) 未见鼻咽癌姜黄素辐射增敏体内试验报道

第二部分 实验目的

EGF、EGFR对鼻咽癌侵袭转移的影响是否通过PKC-细胞骨架改变的途径进行

姜黄素对鼻咽癌侵袭转移能力的影响，是否通过EGF/EGFR-PKC-细胞骨架改变的途径进行姜黄素对鼻咽癌侵袭转移能力的影响，是否通过EGF/EGFR-PKC-细胞骨架改变的途径进行

姜黄素是否可能通过破坏细胞骨架直接杀伤肿瘤细胞姜黄素是否可能通过破坏细胞骨架直接杀伤肿瘤细胞姜黄素是否可以通过抑制PKC活力的途径起到增敏作用

总之，要（通过体内体外试验）探讨姜黄素抑制肿瘤转移及辐射增敏的可能机制。总之，要（通过体内体外试验）探讨姜黄素抑制肿瘤转移及辐射增敏的可能机制。

第三部分 • 技术路线

CNE-2Z 接种裸鼠体外培养姜黄素 MTT RT-PCR 电镜光镜 WB IP IHC 增殖试验侵袭运动试验细胞形态 ACTIN KERATIN TUBLIN EGF EGFR 观察肿瘤生长特性

CNE-2接种裸鼠 对照组姜黄素组放射组姜黄素放射组原发瘤体积的测量转移瘤的数量及体积原发瘤血管密度的检测 PKC 活性的检测

主要实验方法 • 1）鼻咽癌细胞CNE-2Z的复苏培养及裸鼠皮下接种； • 2）光学显微镜、电子显微镜观察姜黄素处理前后CNE-2Z及其裸鼠移植瘤的细胞形态及细胞骨架改变；

主要实验方法 3 ）体外粘附侵袭动力实验检测姜黄素处理CNE-2Z的侵袭动力能力的变化； 4） RT-PCR：EGF、EGFR、actin、keratin和tublin mRNA的转录； 5）Western-blot、免疫荧光化学染色：检测CNE-2Z细胞actin、keratin、tublin、EGF及EGFR的蛋白表达。

动物试验观察各组移植瘤重、体积的变化，瘤组织内血管形成和计数（免疫组化），转移瘤情况，及细胞形态骨架改变。动物试验观察各组移植瘤重、体积的变化，瘤组织内血管形成和计数（免疫组化），转移瘤情况，及细胞形态骨架改变。液相色普法检测各组移植瘤与转移瘤细胞PKC的活性。

第四部分 • 预期结果

1 EGF/ EGFR可以引起CNE-2Z的细胞骨架改变 2 姜黄素对NPC的转移的影响通过EGF/EGFR-PKC-细胞骨架改变的途径进行

3姜黄素对CNE-2Z有直接杀伤作用 4 姜黄素可以通过抑制PKC活性的作用起到增敏效果

进度安排 2003，11~2004，1细胞培养 2005，2~ 6 细胞实验部分 2005，7~ 12 动物实验部分 2006，1 ~3 整理数据，撰写论文。

敬请各位老师批评指正！ 谢谢！

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