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实验 16 大肠杆菌的重组子遗传分析 （ 4 学时） 一、实验目的 了解大肠杆菌的杂交技术，并掌握大肠杆菌的重组子遗传分析。

实验 16 大肠杆菌的重组子遗传分析 （ 4 学时） 一、实验目的 了解大肠杆菌的杂交技术，并掌握大肠杆菌的重组子遗传分析。. 二、基本原理

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实验 16 大肠杆菌的重组子遗传分析 （ 4 学时） 一、实验目的 了解大肠杆菌的杂交技术，并掌握大肠杆菌的重组子遗传分析。

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  1. 实验16 大肠杆菌的重组子遗传分析 （4学时） 一、实验目的 了解大肠杆菌的杂交技术，并掌握大肠杆菌的重组子遗传分析。

  2. 二、基本原理 大肠杆菌的杂交与致育因子F有关。有F因子的细菌称为F十，没有F因子的细菌称为F-。一般F-菌株之间不能进行杂交。F因子有两种状态—游离状态和整合状态（F因子插人到染色体的一定位置上，所以F因子是附加体），前者称F+菌株，后者称为高频重组或Hfr。F+和Hfr都能与F-菌株进行杂交，但重组频率不同。在大肠杆菌的接合中，F+和Hfr是供体菌，而F-是受体菌。在F＋与F-杂交中，F因子由F+供体转移到F-受体，大部份受体变为F+。在Hfr与F-杂交中，Hfr供体的染色体由原点开始转移进人受体菌，但F因子在最后，一般不能转移进入受体，所以受体仍为F-细菌。

  3. 杂交实验有各种不同方法，这里介绍的是直接混合培养和液体培养。直接混合培养法操作简单，适用于确定二个菌株间能否杂交或测定重组频率的高低；而液体培养适宜于细菌的基因定位。杂交实验有各种不同方法，这里介绍的是直接混合培养和液体培养。直接混合培养法操作简单，适用于确定二个菌株间能否杂交或测定重组频率的高低；而液体培养适宜于细菌的基因定位。 在大肠杆菌的Hfr与F-杂交实验中，为了避免供体细菌的生长，必须对供体细菌进行反选择。所以供体要用不同于受体（F-）的营养缺陷型菌株，或对某种抗菌素敏感的菌株，以作反选择的性状。

  4. 根据遗传学的研究，知道大肠杆菌的染色体是环状的、封闭的单倍基因组。在Hfr×F-中，Hfr的染色体由原点开始向F-转移，Hfr细菌的基因按一定的顺序依次地出现在F-受体中。所以离原点较近的基因先进入F-受体，重组频率高，出现的重组子多；而离原点远的基因，进入F-细胞迟，重组频率低，出现的重组子少。因此Hfr菌的基因在重组子中呈梯度出现，提供了基因定位的可能性。根据遗传学的研究，知道大肠杆菌的染色体是环状的、封闭的单倍基因组。在Hfr×F-中，Hfr的染色体由原点开始向F-转移，Hfr细菌的基因按一定的顺序依次地出现在F-受体中。所以离原点较近的基因先进入F-受体，重组频率高，出现的重组子多；而离原点远的基因，进入F-细胞迟，重组频率低，出现的重组子少。因此Hfr菌的基因在重组子中呈梯度出现，提供了基因定位的可能性。

  5. 大肠杆菌的重组频率较低，即使是高频重组，其重组频率也在10-3-10-4。为了在一个较大的杂交群体中发现为数较少的重组子，就要应用选择性培养基。亲本细胞在选择性培养基上不能生长，只有重组子能生长，因此在选择性培养基上长的菌落即为重组子。大肠杆菌的重组频率较低，即使是高频重组，其重组频率也在10-3-10-4。为了在一个较大的杂交群体中发现为数较少的重组子，就要应用选择性培养基。亲本细胞在选择性培养基上不能生长，只有重组子能生长，因此在选择性培养基上长的菌落即为重组子。 • 然后再分析一定数量的重组子中各非选择性标志的分离。在我们的实验中，选用各种糖发酵基因作为非选择性标志，根据各非选择性标记的重组百分数，确定这些糖发酵基因在染色体上的位置。

  6. 本试验的适宜条件是在新鲜的肉汤培养液中，以4×108/毫升的F一细菌和2×10-7/毫升的Hfr混合，其比例是一个Hfr菌对20个F-菌，37℃ 通气接触90分钟。然后稀释取样，以使每皿得到适量的重组子作为原始培养皿，再用影印培养法分析非选择性标志的分离。

  7. 二、实验材料 • 大肠杆菌(Escherichia colt K12） 的四个菌株： • K12 pro(λ)F+；W1485 his ilv F+；W1177 thr leu thi xyl gal ara mtl mal lac strr(λ)F-；HfrC met try。

  8. 三、器皿及试剂 • 1．用具： 培养皿（9厘米），灭菌三角瓶（150毫升），灭菌吸管（1, 5,10毫升），灭菌离心管，灭菌空试管，圆木柱，丝绒。 • 2. 培养基： • (1) 基本培养基Vogel 50×）：MgS04.7H2O 10克，柠檬酸100克，NaNH4HPO4·4H,0 175克，K2HPO4 500克（K2HPO4.3H2O 644克），蒸馏水约1,000毫升（配好后放入冰箱保存备用）。

  9. (2）平板用基本培养基：Vogel 50×2毫升，葡萄糖2克，琼脂2克，蒸馏水98毫升，pH7.0，高压灭菌8磅30分钟。 • (3)液体完全培养基（肉汤培养基）：牛肉膏0.5克，蛋白陈1克，NaCl 0.5克，蒸馏水100毫升，pH 7.2，高压灭菌15磅15分钟。 • (4）固体基本培养基：Vogel 50× 2毫升，葡萄糖2克，琼脂2克，蒸馏水98毫升，pH7.0，高压灭菌8磅30分钟。 • (5）半固体培养基：琼脂0.7-1克，蒸馏水100毫升，pH7.0，高压灭菌15磅15分钟。

  10. (6) EMB培养基（eosin methylene blue伊红美蓝）：糖1克，多陈0.8克，NaCl 0.5克，K2HPO40.2克，伊红0.04克，美蓝0.0065克，琼脂2克，蒸馏水100毫升，pH7.2， 高压灭菌8磅20分钟。 • （7）NaN3培养基：牛肉膏0.5克，蛋白陈1克，NaCl 0.5克，NaN3 0.002M,琼脂2克，蒸馏水100毫升，pH7.2，高压灭菌15磅15分钟。 • 3．生理盐水： • NaCl 0.85克，蒸馏水100毫升，高压灭菌15磅15分钟。

  11. 四、实验步骤 （一）杂交 • 1.菌液制备： • (1)实验前14-16小时，从冰箱保存的斜面菌种，挑少量菌于盛有5毫升完全液体培养基的三角烧瓶中；每一个菌株接种一瓶，共接种4瓶，置37℃培养过夜。 • (2）取出培养过夜的细菌，在W1177一瓶菌液中加人5毫升新鲜的完全培养液，充分摇匀，等量分成2瓶；其余3瓶菌液分别用灭菌的5毫升吸管，各吸出2.5毫升菌液，然后再各加人2.5毫升新鲜的完全培养液，充分摇匀，各菌于37℃ 继续培养3-5小时。

  12. (3）自温箱取出三角烧瓶，分别倒人离心管，菌株W1177 倒二支离心管，其余菌株各倒入一支离心管，离心沉淀，3,500转／分，离心10分钟。 • (4)倒去上清液，加入无菌水，打匀沉淀，离心洗涤3次，再加无菌水到原体积。 • 2．杂交— 混合培养： • (1)取12支灭菌试管，每支吸入3毫升经融化的半固体培养基，并保温在45℃（保温温度不宜高，北方气温低，可降低半固体中的琼脂量）。

  13. (2) 12支试管分成三个杂交组合，即W1177 ×K12pro; W1177 × W1485; W1177 ×HfrC。每个组合各4支试管，其中2支对照，2支混合菌液。 (3）对照组试管各吸F+或Hfr供体菌菌液1毫升，其余按杂交组合各吸供体菌和受体菌菌液0.5毫升，充分混匀。 (4）将各试管中含菌的半固体倒在有Vogel培养基底层的平板上，摇匀待凝，放37℃培养，48小时后观察（图9-1)o

  14. （二）重组子遗传分析 • 1．菌液制备： • (1)实验前14-16小时从冰箱保存的斜面菌种挑少量菌，接种于盛有，毫升液体完全培养基的三角烧瓶中，置37℃ 培养过夜。 • (2）第二天取出菌液，分别先吸出2.5毫升菌液，再各加人2.5毫升新鲜的液体培养基，充分摇匀，继续培养3-5小时。 • (3)自温箱取出三角瓶，分别倒入灭菌离心管， 3500转／分离心10分钟。

  15. (4）倒去上清液，打匀沉淀，各加入新鲜的完全液体培养基到原体积。(4）倒去上清液，打匀沉淀，各加入新鲜的完全液体培养基到原体积。 • (5）从W1177与HfrC各取4.5毫升和0.5毫升菌液，放入一个灭菌的经37℃ 预热的三角瓶中，充分摇匀。 • 2．液体培养： • (1)实验开始前，调节两只水浴锅，温度分别为37℃和45℃，并保持恒温。 • (2）将盛混合菌液的三角瓶置于37℃ 水浴中，保温90分钟。 • (3）融化半固体培养基，并取4支灭菌空试管，每支吸入3毫升半固体培养基，于45℃ 水浴保温。

  16. (4）液体培养90分钟后，取出三角瓶，用1毫升吸管吸取0.1毫升混合菌液，放入1支半固体培养基，摇匀，倒入已加Vogel底层的培养皿中，摇匀，凝固后，37℃培养48小时 。 • (5）取HfrC菌离心沉淀，倒去上清液，再离心洗涤三次，打匀沉淀，加入灭菌生理盐水到原体积，用1毫升吸管吸取0.1毫升HfrC菌液，放入半固体培养基，摇匀，倒人已加Vogel底层的培养皿中，摇匀。凝固后，37℃培养48小时，观察是否长菌落。作为对照。重复两皿。

  17. 重组子遗传分析图解

  18. 3．重组子的遗传分析 • (1)取2只灭菌的培养皿，倒入Vogel培养基，待凝固后用接种针挑取重组子菌落，依次接种到有Vogel培养基的培养皿上（每皿80个菌落），37℃培养24小时，作影印培养的原始培养皿。 • (2)融化EMB培养基（包括6种糖原）和NaN3培养基，每种培养基倒2只培养皿，共14只培养皿。 • (3）取灭菌的丝绒一块，固定在圆柱形木块上，将原始培养皿倒置覆盖在丝绒上，用笔轻敲皿底。一块丝绒复制2只相同培养基的培养皿。当影印不同培养基的培养皿时，应另换一块灭菌的丝绒，重复操作，直至全部影印完毕。经影印的培养皿，放在37℃培养24小时，观察各种性状出现的比例（图10-1）。

  19. 五、实验记录1. 杂交结果：

  20. 2. 重组子的遗传分析： 3. 根据重组百分数，写出这些基因在染色体上的顺序。

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