Molecular characterization of XVSAP1, a stress-responsive

1. Molecular characterization of XVSAP1, a stress-responsive gene from the resurrection plant XerophytaviscosaBaker1 Dahlia Garwe, Jennifer A. Thomson and Sagadevan G. Mundree2 Molecular and Cell Biology Department, University of Cape Town, Private Bag, Rondebosch, 7701, South Africa Eko Amiadji Julianto

2. LATAR BELAKANG • Faktor lingkungan yang merugikan seperti suhuekstremdan tekanan osmotik akibat kondisisalinitas tinggi dan kekeringan, mempengaruhi pertumbuhan, produktivitasdan distribusi tanaman. • Respon terhadap tekananabiotikdimediasi melalui modifikasi fisiologis, morfologisdan metabolisme yg terjadi di semua organ tanaman. • Ekspresi gen dalam menanggapi lingkungan yang berbedahasil rangsangan dari transduksi sinyal kaskade kompleksyang dimulai dengan persepsi stimulus diikutidengan cara pengolahan amplifikasi dan integrasisinyal. • Langkah final adalah reaksi respon dalam bentukde novo ekspresi gen • Meskipun respon umum terhadap stres abiotik miripdi semua tanaman, ada sekelompok tanaman yang dikenal sebagai`Tanaman kebangkitan ‘ (`resurrection plants‘) yang telah mengembangkan mekanismeyang memungkinkan mereka untuk menahan kekurangan air yang parah. • Tanaman Kebangkitan bisa kehilangan lebih dari 90%kadar air mereka, bertahan hidup dalam keadaan kering mereka untukwaktu yang lama dan kemudian melanjutkan hidup aktif saat airmenjadi tersedia lagi.

3. Studitanamanygtoleran pengeringan telah dipelajari dalam beberapa spesiesmewakili kelompok yang berbeda: lumut Tortula ruralis, yangmonokotil porobolus stapfianus (Blomstedt. et al, 1998; Oliver, 1996; Neale et al, 2000) dandikotil Craterostigma plantagineum (Bartelset al., 1990). • Diperkirakan bahwa dua mekanisme dasarada yang memungkinkan tanaman toleran pengeringanuntuk bertahan hidupdalamkekurangan air : • Yang pertamamelibatkan perlindunganterhadapintegritas/kekompakan sel melalui diinduksi dan terjadidgnsendirinya • Kedua melibatkan perbaikan pengeringanatau rehidrasi disebabkan kerusakan. • Sudahditunjukkanbahwabeberapa gen terekspresisecaraberbedaterhadapdehidrasi, sudisecaragenetikmaupunbiokimiamenunjukkanbahwahormon ABA berperanpentingpadaresponterhadapkekeringan, garam, dandingin • ABAjuga memainkan peran penting dalam proses fisiologis sepertisebagai penutupan sel penjaga pada kondisi cekaman kekeringan danregulasi beberapa peristiwa selama pengembangan benih akhir

4. Karakterisasi terhadap gen Em dari gandum (gen yg bertanggung jawab terhadap kekeringan dan diinduksi dgn adanya ABA dan rab 16 A dari padi, berdasar pada ekspresi gen nya (pembentukan enzim/protein menunjukkan bahwa ada alamat yg disebut ABRE yg penting pada proses transkripsi (dr DNA – mRNA), element ABRE terdiri dari 8-10 pasang basa yg intinya berupa ACGT • Sintesis protein dan sangathidrofilik dgn tampilan globulan yg dikenal sbg protein LEA diketahui sbg protein yg bertanggung jawab pada respon terhadap cekaman dehidrasi, salinitas dan dingin, protein ini terakumulasi, berperan sbg osmoletey (menjaga tekanan osmotis sel), LEA berperan penting dalam menjaga membran, pengangkutan ion dan air. • Suhu rendah mempengaruhi fungsi normal dari intergral protein membran seperti protein transporter dan reseptor yg mempengaruhi kelembaban membran • Produk dari gen pengatur dingin seperti COR 6.6 dan COR 78 mungkin melindungi tanamn dari stress dingin • Studi pada Arabidopsis mengungkapkan bahwa elemen pengatur DNA berupa C-yg terulang yg disebut DRE, mempunyai core dgn urutan CCGAC yg yg selalu muncul ditanaman lain, aktifator transkripsi yg menempel pada DRE disebut CBF, dan DREBIA, DRE berperan dalam tempertur rendah dan dehidrasi • Danklud mengidentifikasi gen mirip, WCOR410, yg homolog dgn WCOR 416, protein yg dihasilkan dari gen tersebut terlibat dalam melindungi membran akibat cekaman dehidrasi • WCR 120 yg mengkode protein yg homolog dgn dehidrasi dijumpai diakumulsi sbg respon dingin dimana promotor gen nya dipicu oleh cekaman2 luar

5. Mundree et al. (2000) mengisolasi gen dariX. viscosa yang hasilnya covered dgn E. coli (srl :: Tn10). • Sdh berhasil di isolasi dari cDNA daunX. viscosa. • Protein menunjukkan kemiripan 49% dengan protein tolerandingin WCOR413, dariTriticum aestivum (Danyluk dan Sarhan, 1996). • XVSAP1mirip (56%) dengan protein yg belum terkarakter dari Arabidopsis dimana protein dari Arabidopsis mirip 64% dari WCOR413.

6. Bahan dan metode • Tanaman X. Viscosa dikumpulkan dari Cadangan Alam Buffelskloof(Provinsi Mpumalanga, Afrika Selatan). • C DNA disisipkan pada plasmid pBlue • Dalam pemeliharaan protein yg terbentuk disebut XVSAP1 • Ekspresi XVSAP1 yg ditumbuhkan pada cekaman tekanan osmose, XVSAP1 diklon pada pPro dan ditransformasi ke E Coli • Tanaman eksperimental disiram untuk memastikan hidrasi penuh sebelum percobaan stres.Air Relatifkonten (RWC) determinasi seperti yang dijelaskan oleh Sherwin danFarrant (1996). Konstruksi dan pemutaran bahan cDNA adalahseperti yang dijelaskan sebelumnya (Mundree et al., 2000). Sebuah insert cDNA dipBluescriptSK + (Stratagen, La Jolla, CA) bernama XVSAP1 digunakanuntuk percobaan yang dijelaskan dalam makalah ini.XVSAP1 ekspresi dalam osmotik menekankan Escherichia coliXVSAP1 diklon ke dalam Ekspresi Prokariotik pPROEXHTVector System (Life Technologies, Inc, USA). E. coli (srl :: Tn10)sel diubah dengan pPROEXHT-XVSAP1 membangun dantumbuh di M9 minimal medium dengan 1 mMMgSO4.7H2O, gliserol 0,2%, 0,1% vitamin B, dan 100 mg ml ± 1ampisilin. Kultur sel diinduksi dalam rangkap dengan menambahkan 0,2mM isopropil thiogalactopyranoside (IPTG) setelah OD600 darisel telah mencapai sekitar 0,5. Sel-sel dibiarkan tumbuhselama 2 jam sebelum stres osmotik dipaksakan dengan menambahkan 4Msorbitol dengan konsentrasi final dari 1 M. Pertumbuhan sel adalahdipantau dengan mengambil pembacaan absorbansi pada 600 nm selama 48 jamperiode. Percobaan diulang tiga kali.

7. Analisis urutanXVSAP1(XVSAP1 sequence analysis) • Urutan nukleotida dari XVSAP1 ditentukan dengan menggunakansequenDNAALFexpress • Urutan nukleotida dan perbandinganasam aminodilakukan dengan menggunakan Clustal W • .untuk menkonstruksi pakai DNAMAN digunakan untuk membangun pohon homologi. • Analisis Southern blot • DNA genom dari X. viscosa diisolasi menggunakan DNA tanaman • DNA hasil isolasi dipotong2 denganEcoRI, XhoI, BglII, HindIII dan EcoRV,dielektroforesis • Dilakukan blothing pada membran nilon • cDNA Lengkap dari XVSAP1 dilabel dgn (DIG) , selanjutnya dihibridisasi pada potongan DNA, hasilny diamati menggunakan the ceniluminescanl.

8. Stres induksi (Stress induction) • Tanaman X. Viscosa ditumbuhkan pada kondisi stress, salinitas tinggi • Untuk mengetahui apakah ABA berpengaruh pada ekspresi XVSAP1, daun disemprot dgn ABA • didehidrasi dengan pengurangan air untuk periodedari 2 minggu. Daun yang terlepas dari tanaman sebesar 90%, 78%,63%, 51%, 44%, dan 4% RWC. Sampel daun juga dikumpulkan pada4%, 32%, 42%, 85%, dan 92% pada RWC kembali hydrating. Untuk panasperbaikan tanaman sepenuhnya terhidrasi disimpan dalam phytotron pada 42 ° C(Kelembaban 50 - 70%, 16/8 jam siklus terang / gelap). Tanaman yang disiramsecara teratur untuk menjaga mereka di hidrasi penuh. Untuk mengetahui pengaruhstres dingin, tanaman disimpan pada suhu 4 ° C dan sampel daun diambil setiap 6jam untuk 60 jam. Untuk menguji respon X. viscosa terhadap salinitas tinggi,tanaman irigasi dengan 100 mM NaCl sehari selama 7 d. Cahaya tinggiperbaikan dilakukan dengan mengekspos tanaman terhadap cahaya pada 1500mmol m - 2 s - 1 untuk 4 d dalam phytotron (25 ° C, kelembaban 50 - 70%). Tanamandiirigasi dengan air setiap hari untuk menjaga mereka terhidrasi sepenuhnya. Untukmenentukan apakah asam absisat (ABA) memiliki efek pada ekspresiXVSAP1, X. daun viscosa disemprot dengan phytohormone di sebuahkonsentrasi 100 mM dalam air sekali setiap 24 jam. Dalam semua kasus, daunSampel diambil dari tanaman percobaan sebelum perawatan dimulai (waktu 0). Sampel dikumpulkan setiap 24 jamsetelah itu kecuali untuk perbaikan dingin, di mana sampeldikumpulkan setiap 6 jam. Dalam kasus ABA, sampel diambil setiap 3 jamsetelah perbaikan daun. Semua sampel daun dikumpulkan dibekukandalam nitrogen cair dan disimpan pada -70 ° C sampai digunakan lebih lanjut.

9. Isolasi RNA(RNA isolation) • RNA total diisolasi dengan menggunakan reagen Trizol (Gibco-BRL). daun X.viscosa (200 mg) • RNA dipisahkan dari kotoran dgn di running pada agarose formaldehide dan di cat dgn etidium bromida • Setelah inkubasi selama 5menit pada suhu kamar, 0,2 ml kloroform ditambahkan diikuti olehsebuah inkubasi lebih lanjut pada suhu kamar selama 10 menit. Sampeldisentrifugasi pada 12 000 g selama 10 menit pada 4 ° C dan RNAdiendapkan dengan menggunakan isopropanol. RNA kuantitatif dinilai dgn spektrofotometri,dipisahkan pada 1,2% agarosa gel formaldehiddan diwarnai dengan etidium bromida untuk memverifikasi kuantisasi. • Semi- kuantitatif RT-PCR • RNA diambil dari agarose, direaksikan dgn DNAse untuk menghilangkan DNA kontaminan • Dilakukan transkripsi balik dari RNA menjadi DNA, menggunakan Omniscript reverse transcriptase kit • Selanjutnya cDNA yg terbentuk di PCR dgn potongan primer • Setelah PCR, sampel diselesaikan dengan elektroforesis pada0,8% gel agarosa dan diwarnai dengan etidium bromida.

10. Hasil E coli+plasmid+ XVSAP1 E coli+plasmid Gambar. 1. Analisis pertumbuhan E. coli (srl :: Tn10) sel berubah denganprotein prokariotik vektor ekspresi pPROEXHT (lingkaran terbuka)dan sel-sel ditransformasi dengan pPROEXHT-XVSAP1 (lingkaran tertutup) diMedia minimal. Ekspresi XVSAP1 diinduksi dengan IPTGpada waktu nol. Sel-sel dibiarkan tumbuh selama 2 jam sebelumsorbitol ditambahkan ke konsentrasi final dari 1 M. Sampeldiambil pada interval dan absorbansi pada 600 nm ditentukan. Error barmewakili standar deviasi berdasarkan rata-rata rangkap tigasampel. E Coli tdk dapat tumbuh pada media dgn sorbitol tinggi, cDNA diklon ke plasmid pPRO…, transformasi ke E Coli, E Coli ditumbuhkan dimedia+ sorbitol

11. 42-47 149-154 239-249 Gambar. 2. (A) sekuens asam amino nukleotida dan menyimpulkan dari XVSAP1. Awal dan stop kodon ditunjukkan dengan shading. Nmyristoylation Situs ini ditunjukkan dengan garis putus-putus dan situs prokariotik membran lipoprotein lipid lampiran digarisbawahi oleh garis tebal. Daerah dari enam heliks transmembran ditunjukkan dalam huruf tebal. (B) Sebuah profile hidrofobik dari XVSAP1 protein yang ditentukan olehmetode Kyte dan Doolittle (1982) menggunakan jendela 19 residu asam amino. Keenam domain transmembran diduga ditunjukkan oleh Romanangka

12. XVSAP1 identik 49% dgn WCOR413 protein tahan dingin gandum, 25-56% identik dgn “cold “padi. XVSAP1 identik 70% dgnATCAP arabidopsis Gambar. 3. (A) Perbandingan deduksi urutan asam amino dari protein yang terkait dengan XVSAP1. Protein adalah WCOR413 (GenBank AksesiNo T06810), protein dingin diatur dari gandum, protein yang terkait dingin (-4 ATCAP1: GenBank Aksesi Nos T08404, AAD41971,CAB16776, dan T02423, masing-masing) dari Arabidopsis dan Oryza sativa dingin aklimasi WCOR413-seperti protein (RCAP: GenBankAksesi Nomor AAG13395). Hanya protein Arabidopsis menunjukkan homologi tertinggi yang akan ditampilkan. Persentase mengikuti urutan menunjukkanidentitas persen untuk XVSAP1. Residu asam amino identik ditandai dengan tanda bintang. Asam amino yang serupa ditunjukkan oleh poin. (B) Homologipohon untuk XVSAP1 dan terkait protein.

13. Enzim beda pola hibridisasi beda, ex. Pada jalur 2 ada pita yg menunjukkan hibridisasi, probe XVSAP1 cDNA. Menunjukkan ada multiple copies dari XVSAP1 dalam X viscosa Gambar. 4. Analisis Southern blot DNA genom dari X. viscosa.15 mgDNA dipotong dengan EcoRI / XhoI (jalur 1), BglII (jalur 2), HindIII(Jalur 3), dan EcoRV (jalur 4), dielektroforesis pada gel agarose 1%,ditransfer ke membran nilon dan diperiksa dengan DIG-labelXVSAP1 cDNA.

14. Gambar. 5. Ekspresi XVSAP1 transkrip selama dehidrasi danrehidrasi X. viscosa ditentukan dengan menggunakan RTPCR semi-kuantitatif.PCR produk divisualisasikan pada gel agarosa diwarnai denganetidium bromida. Produk XVSAP1 asli adalah 830 bp danpesaing 345 bp. M mengacu pada jalur penanda. Persentase mengacukadar air relatif (RWC). (A) Tanaman X.viscosadehidrasi dari 90% sampai 4% RWC , RWC oleh air pemotongan untukjangka waktu 2 minggu. (B) Tanaman X.viscosa yang direhidrasilebih dari 5 d dengan penyiraman. (C) Variasi RWC selama dehidrasi -hidrasi X. viscosa.

15. Gambar. 6. Induksi XVSAP1 oleh panas, NaCl, intensitas cahaya yang tinggi, dan perlakuan suhu rendah di X. Viscosa menggunakan semiquantitativeRT-PCR. PCR produk divisualisasikan pada gel agarosadiwarnai dengan etidium bromida. Produk XVSAP1 asli adalah 830bp dan 345 bp pesaing. M mengacu pada jalur penanda. (A) Tanamandisimpan dalam inkubator 42 ° C selama 7 d untuk menginduksi stres panas. (B) Salt stress diinduksi dengan mengairi tanaman pot dengan 100 mM NaCl. (C)Tanaman yang terkena cahaya tinggi pada 1500 mmol m -2 s -1 untuk 4 d dalamphytotron (25 ° C, kelembaban 50 - 70%) untuk perbaikan cahaya tinggi (D) perlakuan dingin dicapai dengan menjaga tanaman pada suhu 4 ° C selama 60 jam.