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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
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dudas denucci@dglnet com br archivo analytical methodologies spanish v97 ppt sitio www gdenucci com
Dudas

denucci@dglnet.com.br

Archivo

Analytical Methodologies spanish v97.ppt

Sitio

www.gdenucci.com

el uso de lc ms ms en estudios de bioequivalencia

El uso de LC-MS/MS en Estudios de Bioequivalencia

Gilberto De Nucci

Unidad Analítica Cartesius

Universidad de São Paulo, Brasil

denucci@dglnet.com.br

t picos
Tópicos
  • La bioequivalencia
  • La espectrometría de masas
  • La opción por un standard interno
  • Los métodos de ionización
  • La preparación de las muestras
  • El experimento de supresión iónica
  • Ejemplos prácticos
  • Conclusión
bioequivalencia
Bioequivalencia

Dos formulaciones de la misma forma farmaceutica producen perfiles de biodisponibilidad equivalentes

la biodisponibilidad puede ser medida a travez de la medida de
La biodisponibilidad puede ser medida a travez de la medida de:
  • Concentración del principio activo o metabolito(s) en fluidos biológicos en función del tiempo.
  • Excreción urinaria del principio activo o metabolito(s) em función del tiempo.
  • Cualquier efecto farmacológico apropiado.
slide7

Parámetros farmacocinéticos

8

6

4

2

0

Cmax

Concentración

tmax

0 3 6 9 12

Horas

slide8

Parámetros farmacocinéticos

8

6

4

2

0

Concentración

AUC 0-12h

0 3 6 9 12

Horas

qu es la espectrometria de masas
Qué es la espectrometria de masas?
  • Efectua la medida de masas (relación masa/carga – m/z)
  • Técnica analítica para:
    • identificar de compuestos desconocidos
    • elucidar estructuras y propiedades químicas
    • cuantificación substancias químicas
  • Apropiado para detección de concentraciones muy pequeñas (tipicamente 10-12 - 10-15 moles)
espectrometria de masas m todos de ionizaci n
Espectrometria de masas - Métodos de ionización
  • Impacto de Electrones (EI)
  • Ionización Química (CI)
  • Ionización a Presión Atmosférica (API)
    • Ionización por ElectroSpray (ESI)
    • Ionización Química a Presión Atmosférica (APcI)
  • Ionización por desorción em matriz assistida por rayos laser (MALDI)
por qu usar api ms
Por qué usar API-MS?
  • Cubre una amplia gama de peso molecular
  • Compatible con gran parte de los compuestos conocidos
  • Diversos tipos de interfaces pueden ser utilizadas (inyección en flujo, HPLC, eletroforesis capilar)
  • Robusto y fácil de usar
tipos de ionizaci n a presi n atmosf rica api ms
Tipos de ionización a presión atmosférica (API-MS)
  • Electrospray (ESI): utiliza campos eléctricos para generar gotas cargadas que se tansforman en spray. Puede ser positivo (ES+) o negativo (ES-).
  • APcI: donde el disolvente actua como gas ionizante
  • APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization): Una Lampara de Kriptonio produce luz UV que ioniza los analitos o dopantes con subsecuente reacción en fase de gas
requisitos para los standard interno i s
Requisitos para los standard interno (I.S.)
  • Estructura química similar (Análogos)
    • el analito y el I.S. devem poseer los mismos grupos funcionales
    • atención especial a la fase de extracción
    • las condiciones de ionización no pueden ser muuy diferentes
  • Isótopos deuterados
    • Se trata del analito marcado isotopicamente
    • Ni siempre está disponible comercialmente
tipos de extracci n de las muestras
Tipos de extracción de las muestras
  • Líquido/Líquido
    • dos fases (acuosa/orgánica)
    • Más rápida
    • Más barata
  • Precipitación de proteinas
    • Muy simple
    • Rápida
    • Muestras más “sucias”
  • SPE (Extracción en fase sólida)
    • Cartuchos de extracción
    • Facilidad para la autmotización
    • Más cara
procedimiento t pico para las extracciones en fase s lida spe
Procedimiento típico para las extracciones en fase sólida (SPE)
  • Adicione las muestras en los tubos de vidrio;
  • Coloque la cantidad de I.S. e agite en vortex por 10 seg.;
  • Aplique las muestras a los cartuchos de SPE (previamente pre-condicionados con metanol y agua), usando una presión positiva;
  • Lave los cartuchos (en general usando água);
  • Aplicar presión positva para asegurar que los cartuchos queden secos;
  • El extracto é posteriormente eluido de los cartuchos usando un eluente apropiado y recogerlo en tubos de vidrio;
  • Resuspender com una solución apropiada e transferirlas en los viales de HPLC;
algunos ejemplos de uso en estudios de bioequivalenccia
Liquido/Liquido

Fluoxetina

Fluconazol

Captopril

Omeprazol

Paroxetina

Diazepam

Bromazepam

Midazolam

Nimodipino

Amlodipina

SPE

Cefalexina

Cefaclor

Amoxicilina

Didanosina

Acyclovir

Losartan

Enalapril

Lisinopril

Algunos ejemplos de uso en estudios de bioequivalenccia
  • Precipitación de proteinas
    • Metil-DOPA
supresion i nica
Supresion iónica
  • Supresión de la señal en el espectrómetro de masas
    • Causada por cualquier interferencia (e.g. sales, proteinas, etc.)
    • Extracción no específica
  • Los efectos de la preparación de muestras en el proceso de ionización devem ser evaluadas
experimento de supresi n i nica
Experimento de supresión iónica
  • Bomba de infusión: una conc. standard de una mezcla de analito/IS (por ejemplo 50 ug/mL a 50 uL.min)
  • Bomba de HPLC: el flujo de fase movil especificado para el ensayo
  • Extrair e inyectar en el sistem así dispuesto una muestra no contaminada
  • Observe lo que pasa con la señal (línea de base)
experimento de supresi n i nica resultado t pico

100

MRM of 2 Channels ES+

%

247 > 204.2

-15

100

237 > 194.2

%

-15

Time

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

Experimento de supresión iónicaResultado típico
experimento de supresi n i nica cromatograma de la muestra

2.32

100

MRM of 2 Channels ES+

%

247 > 204.2

-15

2.37

100

237 > 194.2

%

-15

Time

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

Experimento de supresión iónicaCromatograma de la muestra
sistemas de lc ms ms de la unidad anal tica cartesius
Sistemas de LC-MS/MS de la Unidad Analítica Cartesius
  • Micromass
    • Quattro II (desde 1997)
    • Quattro LC (desde 2000)
    • Quattro Ultima (desde 2001)
    • Quattro Micro (desde 2003)
  • Sciex/Applied Biosystems
    • API 2000 (desde 2002)
sistemas de lc ms ms de la unidad de investigaci n galeno
Sistemas de LC-MS/MS de la Unidad de Investigación Galeno
  • Micromass
    • Q-TOF Ultima (desde 2002)
  • Sciex/Applied Biosystems (desde 2003)
    • 3 equipos API 4000
    • 1 equipo API 3000
m todo anal tico para determinaci n de captopril total
Método analítico para determinación de Captopril total
  • Extracción:Líquido/Líquido usando éter/diclorometano (70/30, v/v) con tratamiento anterior usando ditiotreitol
  • Columna analítica:Jones Genesis C18, 4um (150x4.6 mm id)
  • Fase movil: Isocratica [agua/metanol (40/60; v/v) + 5 mM acetato de amonio + 13 mM ácido trifuoroacético]
  • Flujo: 1.0 mL/min
  • Standard interno: Enalapril
  • Tiempos de retención:
    • 2.6 min (Captopril – MRM 217.2 -> 115.9)
    • 3.6 min. (I.S. - Enalapril – MRM 377.4 -> 234.0)
  • Tiempo total de HPLC:6.0 min
m todo anal tico para determinaci n de captopril total31
Método analítico para determinación de Captopril total
  • Condiciones MS: ES+
  • Sistema: Micromass Quattro II
  • LLOQ: 0.0100 µg/ml
    • CV% = 12.9%
    • Accuracy = 99.3%
  • Inter Batch Precision (CV%)
    • LLOQ = 11.1%
    • Arriba del LLOQ = < 6.6%
  • Inter Batch Accuracy (%)
    • LLOQ = 97.1%
    • Arriba del LLOQ > 92.7%
cromatograma del loq

Captopril 10 ng/mL in plasma

3.65

100

8533

MRM of 2 Channels ES+

377.4 > 234

%

0

2.56

100

275

MRM of 2 Channels ES+

217.2 > 115.9

%

0

Time

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

Cromatograma del “LOQ”
m todo anal tico para determinaci n de midazolam 1 oh midazolam
Método analítico para determinación de Midazolam/1-OH Midazolam
  • Extracción:Líquido/Líquido usando eter/diclorometano (70/30, v/v)
  • Columna analítica:Alltech Prevail C8, 5um (150x4.6 mm id)
  • Fase movil: Isocratica [agua/metanol (35/65; v/v) + 12 mM ácido fórmico]
  • Flujo: 1.5 mL/min
  • Standard interno: Alprazolam
  • Tiempo de retención:
    • 2.0 min (Midazolam – MRM 326.2 -> 281.4)
    • 2.2 min (1-OH Midazolam – MRM 342.3 -> 203.3)
    • 3.3 min. (I.S. - Alprazolam – MRM 309.3 -> 281.4)
  • Tiemppo total de HPLC:4.5 min
m todo anal tico para determinaci n de midazolam 1 oh midazolam35
Método analítico para determinación de Midazolam/1-OH Midazolam
  • Condiciones de MS: ES+
  • Sistema: Micromass Quattro Ultima
  • LLOQ: 0.500 ng/ml (para ambos analitos)
    • CV% = 12.7% (Parent); 18.7% (Metabolito)
    • Accuracy = 85.9% (Parent); 98.9% (Metabolito)
  • Inter Batch Precision (CV%)
    • LLOQ = 10.9% (Parent); 15.9 (Metabolito)
    • Arriba del LLOQ = < 6.0% (Parent); <9.5% (Metabolito)
  • Inter Batch Accuracy (%)
    • LLOQ = 111.3% (Parent); 103.2 (Metabolito)
    • Arriba del LLOQ > 96.4% (Parent); >92.1%
cromatograma del loq36

QL-Midazolam 0.50 ng/mL + 1-OH-Midazolam in plasma

MRM of 3 Channels ES+

2.19;233

100

342.3 > 203.3

%

-15

MRM of 3 Channels ES+

100

2.00;1592

326.2 > 291.4

%

-15

3.30

MRM of 3 Channels ES+

100

21577

309.3 > 281.4

%

Time

-15

1.00

2.00

3.00

4.00

Cromatograma del “LOQ”
m todo anal tico para determinaci n de pantoprazol
Método analítico para determinación de Pantoprazol
  • Sample Extraction:Líquido/Líquido usando eter/diclorometano (70/30, v/v)
  • Columna analítica:Jones Genesis C8, 4um (150x4.6 mm id)
  • Fase movil: Isocratica [acetonitrilo/agua/metanol (57/25/18; v/v) + 20 mM acetato de amonio + 10 mM ácido acético]
  • Flujo: 0.7 mL/min
  • Standard interno: Lansoprazol
  • Tiempos de retención:
    • 3.4 min (Pantoprazole – MRM 383.4 -> 199.6)
    • 3.7 min. (I.S. - Lansoprazole – MRM 369.9 -> 251.6)
  • Tiempo total de HPLC:4.5 min
m todo anal tico para determinaci n de pantoprazol39
Método analítico para determinación de Pantoprazol
  • Condiciones de MS: ES+
  • Sistema: Micromass Quattro II
  • LLOQ: 5.00 ng/ml
    • CV% = 13.9%
    • Accuracy = 93.3%
  • Inter Batch Precision (CV%)
    • LLOQ = 14.0%
    • Arriba del LLOQ = < 4.7%
  • Inter Batch Accuracy (%)
    • LLOQ = 89.4%
    • Arriba del LLOQ > 97.1%
cromatograma del loq40

MRM of 2 Channels ES+

Pantoprazol 5.00ng/mL in Plasma extr

369.95 > 251.58

3.67;42887

100

%

0

MRM of 2 Channels ES+

3.40;273

100

383.84 > 199.63

%

0

Time

1.00

2.00

3.00

4.00

Cromatograma del “LOQ”
m todo anal tico para determinaci n de hidroclorotiazida
Método analítico para determinación de Hidroclorotiazida
  • Extracción:Líquido/Líquido usando eter/diclorometano (60/40, v/v)
  • Columna:Jones Genesis C18, 4um (100x2.1 mm id)
  • Fase movil: Isocratico [acetonitrilo/agua (90/10; v/v) + 2.35 mM hidróxido de amonio]
  • Flujo: 0.2 mL/min
  • Standard interno: Chlorthalidone
  • Tiempo de retención:
    • 1.6 min (Hydrochlorothiazide – MRM 295.8 -> 204.9)
    • 1.6 min. (I.S. - Chlorthalidone – MRM 336.8 -> 189.8)
  • Tiempo total de HPLC:3.0 min
m todo anal tico para determinaci n de hidroclorotiazida43
Método analítico para determinación de Hidroclorotiazida
  • Condiciones de MS: ES-
  • Sistema: API 2000
  • LLOQ: 1.00 ng/ml
    • CV% = 16.8%
    • Accuracy = 100.4%
  • Inter Batch Precision (CV%)
    • LLOQ = 17.1%
    • Arriba del LLOQ = < 6.9%
  • Inter Batch Accuracy (%)
    • LLOQ = 103.1%
    • Arriba del LLOQ > 98.0%
cromatograma del loq44

"LOQ - Hidrochlorothiazide 1.00 ng/mL in plasma extr."

1.31

900

800

700

600

Mass(es): "295.8/204.9 amu"

500

Intensity, cps

400

300

200

100

0

1.6e4

1.32

1.4e4

1.2e4

1.0e4

Intensity, cps

Mass(es): "336.8/189.8 amu"

8000.0

6000.0

4000.0

2000.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

Time, min

Cromatograma del “LOQ”
ejemplo de c mo el experimento de supresion i nica pude ayudar a mejorar um m todo j existente

Ejemplo de cómo el experimento de supresion iónica pude ayudar a mejorar um método já existente

slide46

Estructuras químicasEnalapril/Enalaprilato y Enalapril/Enalaprilato-fenil-d5 (IS)

cromatograma del loq m todo antiguo

Mix Enalapril/Enalaprilat 0.5ng/mL in plasma extr.

100

3.73;13364

MRM of 4 Channels ES+

382.7 > 308.44

%

-15

100

3.79

MRM of 4 Channels ES+

340

377.36 > 303.4

%

-15

100

2.45;21605

MRM of 4 Channels ES+

354.65 > 211.4

%

-15

100

2.48;578

MRM of 4 Channels ES+

349.5 > 206.3

%

-15

Time

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

Cromatograma del “LOQ” – Método antiguo
slide50

CH3CN/H2O (60/40; v/v)

+ 10 mM ácido fórmico

Jones C8 (100 x 2.1 mm id)

Flujo: 0.2 mL/min.

Tiempos totales de HPLC menoras y pérdida de la supresión posterior a la salida del pico

m todo anal tico para determinaci n de enalapril enalaprilato
Método analítico para determinación de Enalapril/Enalaprilato
  • Sample Extraction:Solid phase extraction
  • Analytical column:Jones Genesis C8, 4um (150x4.6 mm id)
  • Mobile phase: Isocratico [acetonitrilo/agua (60/40; v/v) + 12 mM ácido fórmico]
  • Flujo: 0.2 mL/min
  • Standard interno: Enalapril-phenyl-d5/Enalaprilat-phenyl-d5
  • Tiempos de retención:
    • 1.3 min (Enalapril – MRM 377.4 -> 303.4)
    • 1.3 min (Enalaprilat – MRM 349.5 -> 206.3)
    • 1.7 min. (I.S. – Enalapril-phenyl-d5 – MRM 382.7 -> 308.4)
    • 1.7 min. (I.S. – Enalaprilat-phenyl-d5 – MRM 354.6 -> 211.4)
  • Tiempo total de HPLC: 4.0 min
m todo anal tico para determinaci n de enalapril enalaprilato52
Método analítico para determinación de Enalapril/Enalaprilato
  • Condiciones de MS: ES+
  • Sistema: Micromass Quattro LC o Quattro Ultima
  • LLOQ: 0.500 ng/ml para ambos analitos
    • CV% = 12.8% (parent) and 8.1% (metabolito)
    • Accuracy = 97.2% (parent) and 103.3% (metabolito)
  • Inter Batch Precision (CV%)
    • LLOQ = 13.9% (parent) and 10.3% (metabolito)
    • Arriba del LLOQ = < 7.9% and <6.3% (metabolito)
  • Inter Batch Accuracy (%)
    • LLOQ = 99.3% (parent) and 101.2% (metabolito)
    • Arriba del LLOQ > 95.3% (parent) and > 94.2% (metabolito)
problemas encontrados
Problemas encontrados
  • Requisito de bajo nivel de detección (LOQ = 20 pg/mL)
  • Primer intento: Quattro Ultima – Micromass
  • Realización definitiva: API 4000 – Sciex Applied Biosystems
cromatograma para 100 pg ml quattro ultima

0.1ng/mL

2.59

100

MRM of 2 Channels ES+

409.4 > 238.4

%

0

4.57

100

%

MRM of 2 Channels ES+

384.4 > 338.15

0

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

Cromatograma para 100 pg/mLQuattro Ultima
m todo anal tico para determinaci n de felodipino
Método analítico para determinación de Felodipino
  • Sample Extraction:Líquido/Líquido usando eter/hexane (80/20, v/v)
  • Columna analítica:Alltech Prevail C8, 3um (100 x 4.6 mm id)
  • Fase movil: Isocratico [acetonitrilo/agua (80/20; v/v) + 10 mM ácido fórmico]
  • Flujo: 0.8 mL/min
  • Standard interno: Nimodipino
  • Tiempos de retención:
    • 2.3 min (Felodipino – MRM 382 -> 352)
    • 2.1 min. (I.S. – Nimodipino – MRM 419 -> 348)
  • Total Run time:3.5 min
m todo anal tico para determinaci n de felodipino58
Método analítico para determinación de Felodipino
  • Spectrometric Conditions: ES+
  • Sistema: API 4000
  • LLOQ: 20 pg/ml
    • CV% = 20 %
    • Accuracy = 107.8%
  • Inter Batch Precision (CV%)
    • LLOQ = 17.3 %
    • Arriba del LLOQ = < 7.4%
  • Inter Batch Accuracy (%)
    • LLOQ = 101.3%
    • Arriba del LLOQ > 93.1%
m todo anal tico para determinaci n de ciclsoporina a en sangre
Método analítico para determinación de Ciclsoporina A en sangre
  • Extracción:Líquido/Líquido usando eter/hexano (80/20, v/v)
  • Columna analítica:Alltech Prevail C8, 5um (150x4.6 mm id)
  • Fase movil: Isocratico [acetonitrilo/agua/metanol (57/25/18; v/v) + 10 mM acetato de amonio]
  • Flujo: 2.0 mL/min
  • Standard interno: Ritonavir
  • Tiempos de retención:
    • 1.3 min (Ciclosporina A – MRM 1220.4 -> 1203.1)
    • 2.0 min. (I.S. – Ritonavir – MRM 721.3 -> 295.5)
  • Tiemppo total de HPLC:4.0 min
analytical method cyclosporin a in human blood
Analytical MethodCyclosporin A in human blood
  • Condiciones de MS: ES+
  • Sistemas: Micromass Quattro II
  • LLOQ: 0.02 µg/ml
    • CV% = 9.8%
    • Accuracy = 116.6%
  • Inter Batch Precision (CV%)
    • LLOQ = 16.0%
    • Arriba del LLOQ = < 12.4%
  • Inter Batch Accuracy (%)
    • LLOQ = 101.5%
    • Arriba del LLOQ > 106.5%
cromatograma del loq62

QL1 0.02ug/ml in blood

1.28

100

MRM of 2 Channels ES+

24953

721.29 > 295.55

%

0

2.03;179

MRM of 2 Channels ES+

100

1220.41 > 1203.12

%

-1

Time

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

Cromatograma del “LOQ”
conclusi n
Conclusión

La técnica de LC-MS/MS es muy apropiada para la cuantificación de principios activos em fluidos biológicos para estudios de bioequivalencia ya que presenta:

  • Sensibilidad
  • Selectividad
  • “Through-put”
  • Robustez
  • Facil manoseo
equipo t cnico de la unidad anal tica cartesius
Jaime Ilha – Coordenador

Rafael Barrientos – Gerente

Eduardo Zappi – INg. De mantenimiento

Mauro Sucupira - Supervisor

Paulo Galvinas - Supervisor

Vinícius Rezende - Supervisor

Yuri Vannuchi – Analista

Eder Resende - Analista

Marcus Araújo – Analista

Kleber Junior – Analista

Jairo Fernandes - Analista

Simone Medeiros – Auxiliar de analisis

Equipo técnico de la Unidad Analítica Cartesius

Prof. Gilberto De Nucci - Director

  • Marcia Sucupira – Auxiliar de lab.
  • Maurifran Alves – Auxiliar de lab.
  • Ricardo Balbino – Auxiliar de análisis
  • Debora Rodrigues – Asistente de la Garantia de de la Calidad
  • Mário Baldini – Auditor interno
  • Cássio Alves – Gerente de la Garantia de Calidad
  • Gustavo Mendes - Bioestatísitico
  • Pedro Babadopulos - Webmaster