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PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA I. Purificación de proteínas Biomodel TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN CON DNA. TÉCNICAS BÁSICAS DE INVESTIGACIÓN CON DNA. Polymerase Chain Reaction (PCR) Clonación de DNA Secuenciación de DNA Técnicas de hibridación molecular: Northern y Southern Blot
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PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA I • Purificación de proteínas • Biomodel • TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN CON DNA
TÉCNICAS BÁSICAS DE INVESTIGACIÓN CON DNA • Polymerase Chain Reaction (PCR) • Clonación de DNA • Secuenciación de DNA • Técnicas de hibridación molecular: • Northern y Southern Blot • Microarrays de DNA
SECUENCIACIÓN DEL DNA * Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA). Frederick Sanger • *Elementos necesarios: • - DNA polimerasa • - Oligonucleótido (primer o cebador): • • 18-30 nucleótidos • • complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar • - Mezcla de los 4 desoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) • - Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidos trifosfato • (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*)
OH SECUENCIACIÓN DEL DNA * Reacción de la polimerasa: Enlace fosfodiéster entre 3’-OH de la cadena cebadora y P del dNTP (liberación de PPi). Desoxi nucleótido Didesoxi nucleótido (bloqueo de la síntesis de DNA) dNTP
SECUENCIACIÓN DEL DNA • Método antiguo • Nucleótidos marcados con 32P • 4 tubos de reacción • (1 para cada ddNTP) • Lectura: electroforesis • y autorradiografía Por interrupción de la síntesis se generan múltiples fragmentos de los cuales conocemos el nucleótido en posición 3’ y de los cuales podemos determinar el tamaño mediante electroforesis en gel determinación de la secuencia.
SECUENCIACIÓN DEL DNA • - Secuenciador automático (detección por fluorescencia) • - Usa 4 ddNTPs unidos a una molécula fluorescente (de diferente color para cada uno) • Una única reacción • Lectura: electroforesis en gel capilar, láser + detector fluorescencia (automatizado)
* Nature Vol 453, 8 May 2008
TÉCNICAS BÁSICAS DE INVESTIGACIÓN CON DNA • Polymerase Chain Reaction (PCR) • Clonación de DNA • Secuenciación de DNA • Técnicas de hibridación molecular: • Northern y Southern Blot • Microarrays de DNA
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN MOLECULAR • * Se basan en el uso de sondas de DNA específicas: fragmentos de DNA de cadena simple, complementarios a parte de la secuencia de DNA o RNA que pretendemos detectar hibridación. • * Las sondas contienen algún marcador que nos permite visualizarlas (isótopos radioactivos, fluorocromos…) detección de la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria.
Southern y Northern Blot Permiten identificar una secuencia de DNA (Southern Blot) o RNA (NorthernBlot) que nos interesa, mediante hibridación con sondas de DNA. Southern Blot detección de la presencia de un gen en el genoma Northern Blot detección de la expresión de un gen Southern Blot
Southern Blot * Fingerprints de DNA o huella genética: - Análisis de RFLP (polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción) - Actualmente son más usadas técnicas basadas en la PCR (amplificación de múltiples fragmentos con secuencias altamente variables) Each individual has a unique and characteristic combination of nucleotides in their DNA. This unique combination can be analyzed and used for definitive identification. To do this, the person’s DNA is first cut into small fragments by the action of restriction endonucleases. Different pieces of DNA are produced by using combinations of different enzymes, and the pieces produced by each person’s DNA are unique. The DNA fragments produced are then separated by gel electrophoresis to produce patterns characteristic of the person from which the DNA was obtained.
Homocigotos recesivos (TT) Heterocigotos (CT) RFLP * Por RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorfism) pueden diagnosticarse algunas enfermedades genéticas: anemia falciforme, corea de Huntington, fibrosis quística, síndrome de estrés porcino… * Ejemplo: Síndrome de estrés porcino (o hipertermia maligna) - Muerte súbita en situaciones de estrés carnes PSE (pale, soft and exudative) - Mutación gen del receptor de la rianodina (Ryr 1): cambio CT (Arginina Cisteina) - Enfermedad autosómica recesiva - Diagnóstico por PCR-RFLP: Elimina diana para HinP1 Genera diana para HgiA1 Mutación Homocigotos dominantes (CC) Normal (C) Mutado (T) Gen Ryr1 PCR Restricción enzimática (HinPI) Electroforesis
MICROARRAYS DE DNA * Permiten comparar patrones de expresión entre dos estados celulares (p.ej. normal-enfermo, entre tipos celulares, entre diferentes fases del desarrollo…) Microarray o microchip: Superficie con diferentes secuencias conocidas de DNA inmovilizadas (cada punto se corresponde con un determinado gen).
Canal 1 Canal 2 Rango de Intensidades Max 0 Canal 1 Canal 2 MICROARRAYS DE DNA canal 1 canal 2 <1 ……….1 ………. >1
