JABUČNO-MLIJEČNA FERMENTACIJA

1. JABUČNO-MLIJEČNA FERMENTACIJA Nena Peričić Katarina Primorac Mia Šiško

2. Uvod • Jabučno-mliječna fermentacija (JMF) poznatija kao Malolaktična fermentacija (eng. malic acid, lactic acid=malolactic ferm.) • Ključni korak u proizvodnji većine crnih kao i mnogih bijelih vina i pjenušaca. • JMF je proces biološkog otkiseljavanja vina u kojem se dikarboksilna L-jabučna kiselina pretvara u monokarboksilnu L-mliječnu kiselinu i ugljikov(IV)-oksid

3. Proces provode provode bakterije mliječne kiseline (BMK) iz rodova Oenococcus, Pediococcus i Lactobacillus. • Degradacija jabučne u mliječnu kiselinu tijekom JMF rezultira padom titracijske kiselosti i malim porastom pH vrijednosti. • Smanjenje kiselosti vina ovisi prije svega o početnoj koncentraciji jabučne kiseline u grožđu koja ovisi prvenstveno o klimatskim uvjetima i terminu berbe, a kreće se između 1.5 – 5 g/L. • Tijek procesa mora biti kontroliran i usmjeravan • Mekši, blaži i zaobljeniji okus vina

4. BAKTERIJE MLIJEČNE KISELINETaksonomija • BMK izolirane iz grožđanog mošta uključuju Lactobacillus, Oenococcus i Pediococcus vrste. • U odnosu prema šećeru dijele se prema navedenoj tablici.

5. Za sve BMK zajedničko je da su: • Gram – pozitivni mikroorganizmi • Nepokretni i nesporulirajući • Fakultativni anaerobi • Kemoorganotrofni organizmi • Optimalna temperatura za rast i razvoj 20° - 30°C Osim oblika, odlučujući čimbenik za njihovu klasifikaciju je homo ili heterofermentativni metabolizam šećera. Homofermentativne bakterije mogu fermentirati šećer do mliječne kiseline, dok heterofermentativne bakterije fermentiraju šećer do ugljičnog dioksida, etanola, octene i mliječne kiseline. Oenococcus oeni predstavlja najboljeg „kandidata“ za vođenje JMF zbog svoje otpornosti na razne uvjete okoline, naročito u kiselim uvjetima i pri visokoj koncentraciji alkohola, što je tipičan medij za vino. Inokulacijom pomno odabranih sojeva Oenococcus oeni, omogućava se vinaru veća kontrola nad JMF

6. BAKTERIJE MLIJEČNE KISELINEMetabolizam • Energiju potrebnu za metabolizam pronalaze u oksidaciji kemijskih komponenti --> kemotrofni org. • METABOLIZAM ŠEĆERA Fermentacija šećera glavni je način dobivanja energije za rast BMK. Koriste glavne heksoze u vinu, glukozu i fruktozu, kao izvore energije i dušika. U tom pogledu konkurenti su proizvodnji etanola od strane kvasca Saccharomyces cerevisiae. - METABOLIZAM ORGANSKIH KISELINA BMK u suštini razgrađuju dvije organske kiseline iz vina, i to jabučnu i limunsku kiselinu. Razgradnja jabučne i limunske kiseline igraju veliku ulogu u proizvodnji vina u pogledu otkiseljavanja koje je praćeno promjenom pH vrijednosti te mikrobiološke stabilnosti. Te razgradnje također i primjetno mijenjaju senzorna svojstva vina.

7. Osim jabučne kiseline BMK (L.plantarum, L.casei, O.oeni i L.mesenteroides) sposobne su razgraditi i limunsku kiselinu do diacetila, acetoina i 2,3 butandiol-a. Diacetil je jedna od najvažnijih mirisno-okusnih komponenti koja vinu daje karakterističnu aromu maslaca ili lješnjaka ako je ispod praga detekcije.

8. Rast i razvoj BMK u vinu • povoljni uvjeti: prisustvo hranjiva, izostanak toksičnih čimbenika i adekvatna temperatura. Većinu energije potrebne za svoj rast i razvoj BMK nalaze razgradnjom brojnih organskih spojeva; šećera, aminokiselina i organskih kiselina. HRANJIVA, VITAMINI I ELEMENTI U TRAGOVIMA • Ugljik, dušik i mineralni elementi (fosfor i sumpor) - sastavni dijelovi stanica BMK. • Najzastupljeniji šećeri u vinu su heksoze (glukoza i fruktoza) • Manoza, galaktoza, pentoze (arabinoza, ksiloza i riboza), ramnoza i disaharidi - zastupljeni u manjoj mjeri ( po nekoliko miligrama svaki). • Potrebno je manje od 1g/L glukoze za stvaranje dovoljne biomase BMK za početak JMF . • Aminokiseline oprkrbljuju BMK asimilativnim dušikom. • Minerali magnezij, mangan, kalij i natrij • Vitamini su koenzimi ili koenzimski prekursori.

9. “Procesi prije bioreaktora” • Odabir i selekcija bakterija --> Oenococcus oeni • Priprava predkulture Prilagodba Oenococcus oeni u vinu je problematična jer nakon inokulacije velik broj stanica ugiba. Zato treba dodati predkulturu razvijenu u sredini koja otprilike odgovara sastavu vina. - pripremi se mošt razrijeđen sa 50 % vode (pH oko 4.5) - doda se 5g ekstrakta kvasca  Ovu sredinu se inokulira sa bakterijama (temp. 25°C.) Nakon cca 7 dana doda se u mošt ili vino. Predkulture Oenococcus oeni mogu se dodati u tri različita trenutka vinifikacije: - u mošt prije fermentacije - u mošt u punoj fermentaciji - u vino nakon alkoholne fermentacije

10. “Bioproces”Faktori koji utječu na provođenje JMF

11. TEMPERATURA - utjecaj na rast i razvoj, dužinu LAG faze i na maksimum populacije BMK. - Temperaturni optimum za vrstu Oenococcus oeni je 20 – 23 ⁰C - Rast i razvoj BMK slabi s padom temperature te na oko 14-15 ⁰C prestaje. ALKOHOL/ETANOL - ↑ konc Et-OH ↓ opt. temp. za rast i razvoj - rast u prisustvu od 10 volumnih % etanola - udio vrsta sposobnih za rast ↓ se kako koncentracija Et-OH ↑. - postoje bakterijske vrste u vinu s 20 vol % etanola pH - ključni čimbenik - pH<3.5 Oenococcus oeni - pH>3.5 Lactobacillus i Pediococcus spp. SUMPOR - usporava rad malolaktičnih bakterija - ukupni SO2 50-100mg/L - slobodni SO2 do 10 mg/L - Kod ↓ pH vrijednosti i relativno niske doze SO2 mogu stvarati velike probleme.

12. MASNE KISELINE - Dekadska i dodekadska najčešće su masne kiseline u vinu - u konc. 12.5 mg/L i 2.5 mg/L stimuliraju malolaktičnu aktivnost u 4% etanolnoj otopini INTERAKCIJA KVASACA I BAKTERIJA MLIJEČNE KISELINE - Kvasci mogu djelovati i neutralno, stimulirati ili inhibirati aktivnost BMK. Interakcija ovisi o: -sojevima uključenim u fermentaciju i JMF -sastavu nutrijenata u vinu -sposobnošću kvasaca da proizvode metabolite koji su stimulatori ili toksini za BMK. - Sastav mošta, kao i vinarska praksa utječu na ovu interakciju LIZOZIM - enzim bjelanjka kokošjeg jaja (0.3%) - baktericidan je za mliječno kisele bakterije Dobra svojstva lizozima: -nema alergijskih učinaka -potpuno je netoksičan -nema mirisa ni okusa Primjenom lizozima odgađa se JMF bez primjene sumpora , te bez provođenja uobičajenih mjera hlađenja, pretakanja sa taloga i slično.

14. Starter kulture • selekcionirane kulture bakterija • inokulacijom se osigurava razgradnja jabučne kiseline u što kraćem vremenu. • Inokulacija ne osigurava 100% provedbu razgradnje jabučne kiseline,ali značajno povećava mogućnost njene provedbe. • postoji mogućnost poticanja JMF dodatkom manje količine vina, u kojima je ona u tijeku, u vinu gdje se želi postići.

15. Utjecaj JMF na sastav i aromu vina Pozitivni učinci Negativni učinci Promjena senzornih svojstava Promjena boje vina Tvorba biogenih amina • Smanjenje kiselosti • Promjene senzornih svojstava • Mikrobiološka stabilnost vina

16. Utjecaj JMF na sastav i aromu vina • BMK mogu utjecati na aromu vina hidrolizom prekursora arome, glukozidno vezanih terpena • Glukozidazna aktivnost bakterije ovisi o koncentraciji etanola i konc. šećera

17. DIACETIL • Maslačni karakter • Nastaje za vrijeme alkoholne i JMF • Sintetizira se iz citrata i drugih UH preko piruvata • Diacetil mogu ireverzibilno razraditi kvasci i BMK • 2,3-butandion = konačni produkt razgradnje diacetila ( nema utjecaj na aromu) ACETALDEHID • Formira se za vrijeme fermentacije metabolizmom kvasaca • Kopigmentacija-razvoj boje vina • BMK imaju sposobnost razgradnje acetaldehida • Poželjan u nižim koncentracijama • U visokim koncentracijama daje negativnu aromu vinu ETIL- LAKTAT • Sintetizira se tijekom JMF • Sinteza povezana s proizvodnjom mliječne kiseline • Daje puniji okus vinu • Esterificira se tijekom starenja vina ETIL - ACETAT • Konc. se može povećati kao rezultat metabolizma BMK • Voćna aroma (konc. ispod 100mg/L) • Miris na otapalo (konc. iznad 150mg/L) OCTENA KISELINA i ETANOL • Produkti razgradnje acetaldehida • Ne utječu na senzorna svojstva vina jer su nastale koncentracije niske

18. Zaključak • Jabučno-mliječna fermentacija poželjna je kod vina s visokom ukupnom i jabučnom kiselinom. Poželjna svojstva nakon provedene JMF su niža kiselost, pozitivne promjene u senzornim svojstvima i mikrobiološka stabilnost, iako je JMF proces koji može i narušiti senzornu sliku vina. Stoga, tijek ovog procesa mora biti kontroliran i usmjeravan, kako bi imao pozitivne učinke na kakvoću i stil vina. Izbor pogodnog soja bakterija mliječne kiseline sa dobro poznatim svojstvima u kombinaciji sa određenim enološkim metodama daje vinaru kontrolu nad razvojem aromatskog profila vina.