谷胱甘肽转硫酶的制备 及动力学研究

1. 谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究 实验内容： （一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 （二）测定酶活力、米氏常数和最大反应速度 （三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计算比活力

2. 谷胱甘肽转硫酶简介 谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，简称GSTs，EC2.5.1.18）广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体，相对分子质量为45 000—49 000，各同工酶的等电点不同，多为碱性同工酶。

3. 兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

4. GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽（GSH）的亲核基团GS－反应，中和它们的亲电部位，使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。另外，GST还能共价或非共价地与非底物配基以及多种疏水化合物结合，具有结合蛋白的解毒功能。

5. 亲和层析原理 有很多生物大分子与相应的分子间具有专一的可逆结合的特性，如酶与其底物、抑制剂、辅助因子，抗体与抗原，核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋白，激素与其受体、载体蛋白，细胞与其表面特异蛋白等等，它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力的称为亲和力。亲和层析的方法就是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和发展起来的。

6. 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸附使待分离物质得以纯化。 亲和层析的优点：专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质；具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品；利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。

7. b. a. 载体 手臂 配基 亲和吸附剂 配基 待分离的 生物分子 亲和层析法分离生物大分子示意图

8. c. 样品 杂质 d. 与待分离物质专一可逆结合的物质

9. 亲和层析介质的制备 配基的选择：选择合适的配基是亲和层析中的重要环节，配基可以是有机小分子、生物大分子、染料等。根据待分离物质在溶液中与配基之间的亲和力的大小和专一性等特性进行选择，通过实验来确定理想的配基。例如选择酶的竞争性抑制剂、底物和辅助因子类配基可以纯化酶，选择互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配基可以纯化核酸等等。在亲和层析中，分离生物大分子的配基必须有适当的化学基团能与活化基团发生偶联作用，有较高的偶联率，偶联后配基和被分离生物大分子的专一结合特性不变，有效地分离目标产物；解吸附时不破坏生物大分子的生物活性和理化性质。

10. 载体的选择：亲和层析的载体一般是凝胶类层析介质。一般比较理想的载体应具备稀松的多孔网状结构，对于溶液具有良好的亲水性、流动性和渗透性，大孔径凝胶介质可以有效地使凝胶内部的羟基得到活化，以保证较高的活化效率，提高了配基的有效浓度，提供较高的亲和容量；必须有足够数量的化学基团，经化学方法活化后，可以与大量的配基相偶联；具有良好的机械性能，保证亲和柱维持较好的流速；必须是不溶于水、化学惰性的，非特异性吸附作用弱；有良好的物理和化学的稳定性，在配基偶联、亲和层析、再生处理过程中不会因离子强度、温度、pH的变化，变性剂、去污剂的应用而破坏载体的物理化学结构，在介质的反复使用过程中能抗微生物和酶的侵蚀。载体的选择：亲和层析的载体一般是凝胶类层析介质。一般比较理想的载体应具备稀松的多孔网状结构，对于溶液具有良好的亲水性、流动性和渗透性，大孔径凝胶介质可以有效地使凝胶内部的羟基得到活化，以保证较高的活化效率，提高了配基的有效浓度，提供较高的亲和容量；必须有足够数量的化学基团，经化学方法活化后，可以与大量的配基相偶联；具有良好的机械性能，保证亲和柱维持较好的流速；必须是不溶于水、化学惰性的，非特异性吸附作用弱；有良好的物理和化学的稳定性，在配基偶联、亲和层析、再生处理过程中不会因离子强度、温度、pH的变化，变性剂、去污剂的应用而破坏载体的物理化学结构，在介质的反复使用过程中能抗微生物和酶的侵蚀。

11. 琼脂糖凝胶：目前应用最多的琼脂糖凝胶是瑞典Pharmacia公司生产的Sepharose，它具有理想载体的特性。它是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的大分子多聚糖，靠糖链之间的次级键交联成的稳定网状结构的珠状凝胶，网状结构的疏密依靠改变琼脂糖浓度的方法来控制。如Sepharose 2B，4B和6B，其中阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量，机械强度随凝胶浓度降低而减弱。目前广泛使用Sepharose 4B来分离生物大分子， 本实验采用的是本院自己研制的SepharoseQT4，相当于Sepharose4B。琼脂糖凝胶的多聚合链不是由共价键连接而成的，在使用中应当注意的问题有受热失去稳定性，引起部分溶解，故不宜加热消毒，低温保存，冻结会破坏其结构，要避免在pH低于4高于9下长期工作，使用破坏氢键的试剂会降低凝胶的稳定性，一般情况下不能进行干燥，适宜湿态保存。

12. 常用活化剂：活化剂一般用溴化氰和环氧氯丙烷较多，二者各有利弊： (1)溴化氰：溴化氰活化载体是目前用得最多、效果最好的活化方法。活化效率高，速度快。缺点是溴化氰容易分解产生剧毒的氢氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的结合。 (2)环氧氯丙烷：环氧氯丙烷活化效率高，活化臂较长，有利于生物大分子的结合。毒性很小，可以在常规条件下操作。缺点是活化温度较高，45－50℃，活化时间较长。

13. 偶联条件的选择： (1)偶联pH值：配基偶联最佳pH在8-10之间最有效，在这个pH范围内配基上的氨基多是非质子化形式，要尽可能地选用碱性条件。但是在高pH值时，可能会改变配基的高级结构，甚至丧失活性，所以在偶联时pH的选择要根据具体情况而定。 (2)偶联温度和时间：溴化氰活化的载体，一般都在4℃左右偶联过夜，也可以室温（20-25℃）下反应2h。环氧氯丙烷活化的载体，一般在35－45℃偶联。偶联时间要根据配基的浓度来确定，一般情况要16－24小时。 (3)偶联配基的浓度：偶联时并不总是需要大量的配基才能制成高效的亲和吸附剂，高浓度配基的偶联可以增加结合强度、空间位阻和非特异性结合，空间位阻可以引起亲和吸附剂结合效率的降低，尤其是当高浓度大分子蛋白被偶联时。对于多数亲和吸附剂选用的配基浓度是1-20µmol/mL gel，2µmol/mL是最常用的配基使用量。

14. 亲和层析技术 吸附条件的选择 ：纯化生物大分子一般采用柱层析吸附法，根据亲和吸附剂的吸附容量和待分离物质的总量选择大小合适的层析柱。选择吸附条件时要考虑平衡缓冲液的组成、pH范围和离子强度，样品上柱的体积、温度和流速等因素，使亲和介质与被分离物质具有较强的亲和力。样品溶液的pH和离子强度要与平衡缓冲液一致，一般接近中性。假如样品中杂质多，纯化对象与配基结合力弱时，可以控制样品上柱的流速或重复过柱，以使纯化对象与配基间充分起作用。样品上柱后，用平衡缓冲液除去未吸附的杂蛋白，也可以用较高离子强度的盐溶液进一步洗去非专一吸附的杂质，尽可能在亲和柱上只留下专一吸附的结合物。

15. 洗脱条件的选择 ：亲和层析的洗脱属于特异性的解离方式，洗脱剂的选择必须不引起待分离物的变性失活。洗脱剂多数采用改变层析条件如改变pH、离子强度或缓冲液组成的方法，使固定化配基和生物大分子之间的亲和力降低，以致解开二者的结合。主要有几种基本洗脱类型： (1)竞争性洗脱：特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱，即在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基，这些水溶性的配基和固定相配基相互竞争与大分子结合，由于前者游离的配基较高，结合力大大超过后者时，将被吸附的大分子洗脱下来。使用亲和力更强的配基或底物洗脱效果更好。洗脱液中配基或底物的浓度要根据配基与结合物亲和力的大小来决定。 (2)离子强度洗脱：洗脱液离子强度增加有利于洗脱，可以是一步法或梯度变化，在强离子的作用下，使亲和层析的结合力减弱，将被吸附物洗脱下来。增加盐浓度可以使被吸附物解吸附，NaCl是最常用的盐。

16. (3)pH＋离子强度洗脱：pH的变化改变结合位点上带电基团的离子化程度，解吸附一般是降低pH， pH使用的限度要考虑载体、配基和被吸附物质的化学稳定性。pH变化和离子强度双重作用洗脱适合结合得比较牢的物质。 (4)变性剂洗脱：有的蛋白质在亲和介质上结合得比较牢固，在一定浓度的变性剂中有较好的稳定性，这样可以在洗脱液中加入变性剂，如盐酸胍，尿素等，有利于蛋白质的解离。另外，亲和介质多次使用后，柱效下降，用变性剂可以将吸附比较牢固的杂质洗净，使亲和介质再生。 (5)化学断裂：当一些蛋白质与亲和吸附剂结合牢固，上述洗脱方法或用上述方法洗脱被吸附的大分子会发生不可逆失活时，可以采用专一的化学方法将配基和载体之间的连接键裂解，获得配基—蛋白质复合物。这个方法的缺点是亲和吸附剂使用一次后，需要重新与配基偶联后，才能再次使用。

17. 洗脱方式：亲和层析的洗脱方式，原则上与离子交换层析的洗脱方式相似，主要有以下三种方式：洗脱方式：亲和层析的洗脱方式，原则上与离子交换层析的洗脱方式相似，主要有以下三种方式： (1)一步洗脱：属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下来，就可得到较纯的分离物。非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、温度和介电常数等因素的影响，有效的洗脱液既能改变被吸附蛋白质的构象以降低蛋白质与配基之间的亲和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。 (2)分步洗脱：属于选择性洗脱方法，应用于基团特异性吸附剂，亲和吸附剂上吸附有特异性不尽相同的多组分样品，用几种不同的洗脱条件分几步洗脱，可以将亲和力大小不同的组分分开。 (3)梯度洗脱：属于选择性洗脱方法，利用洗脱液的浓度梯度变化，即解吸附能力逐渐增强，对于吸附性质相同、特异性程度不同的酶和同工酶有效地洗脱。梯度洗脱比分步洗脱更有可能得到较纯的分离对象。此方法需要有梯度混合仪来实现洗脱液的梯度变化。

18. 影响亲和层析的主要因素 ： (1)样液体积的影响：在平衡条件下分离对象与固定化配基能紧密结合时，样品溶液上柱时对体积要求不很严格，亲和吸附剂的吸附总容量能被充分利用。与吸附剂结合力弱的样品浓度要高，避免和非吸附物质一起流掉。 (2)流速的影响：发生亲和吸附时配基与生物大分子之间达到结合反应平衡是一个缓慢的过程，因此样品上柱的流速应保证被结合物与配基之间有足够的时间达到吸附平衡，尤其是弱的亲和吸附剂。如果流速较快，样品中蛋白质浓度又相对高时，往往有少量的待分离样品和杂蛋白一起流出柱子，所以亲和层析上柱样品浓度大时，如组织匀浆液、腹水等，上柱前可将溶液适度稀释，降低溶液的粘度并使亲和吸附反应完全。洗脱时为得到尖锐的洗脱峰、被分离物最小的洗脱体积和最大的回收，一般采用低的洗脱速度。

19. (3) 柱长的影响：多数情况下根据亲和介质的吸附容量和待纯化样品的总量确定柱子的大小。如果亲和介质的吸附容量高，可选择较短的柱子，用较慢的线性流速，使待分离物质得以快速分离；如果亲和吸附剂的亲和性很低，选择相对较长的柱子，保证待分离物与亲和介质有充分接触的时间，使二者较好地结合。 (4) 温度的影响：温度效应在亲和层析中非常重要，亲和介质的吸附强度随温度升高而减小。所以在亲和层析中可以利用不同的温度吸附和洗脱有利于蛋白质的亲和纯化，以得到亲和层析最好的结果。一般选择在4℃进行吸附，在不影响生物大分子活性的较高温度下如25℃进行洗脱。

20. 亲和层析法分离GST的试剂 • 缓冲液A：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl • 缓冲液B：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/L DTT 注：根据酶的性质在分离纯化过程中需要加入适量的金属鳌合剂、还原剂等，以保持酶的活性。

21. 亲和层析法分离GST操作步骤 1. 亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备： Sepharose 4B在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化，将GSH偶联到载体上，制成专一吸附剂。 2. 亲和层析柱的准备： 装柱，柱床体积约4—6mL（柱高约2—3cm），连接蛋白监测系统，用Buffer A平衡（约10—20mL），至记录仪基线平稳。

22. 3. 上柱样品的准备： (1) 按照两组4g兔肝，剪碎，加入约10倍组织重的Buffer A，用组织捣碎机匀浆。 (2) 匀浆液先用低速离心机离心10min，弃沉淀，上清再次离心（4°C，100 000g，40min），弃沉淀，滤纸过滤上清液。 4. 亲和层析柱分离GST： (1) 上柱：将滤液上柱，流速约4—5秒1滴。 (2) 平衡：用Buffer A洗去杂蛋白至柱中介质变白，记录仪回到基线。 (3) 洗脱：用Buffer B洗脱，流速约4—5秒1滴，收集洗脱峰（约5mL），分装冷冻。

23. 亲和层析分离GST示意图 平衡 洗脱 上样