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El inhibidor tirosina quinasa multidiana AEE788 ejerce efectos antiproliferativos en células de cáncer de colon mutadas en BRAF. - + - + - +.

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Conclusiones

El inhibidor tirosina quinasa multidiana AEE788 ejerce efectos antiproliferativos en células de cáncer de colon mutadas en BRAF

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Araceli Valverde Estepa1, Auxiliadora Gómez-España2, Vanessa. Hernández1, Jerónimo Jiménez2, Laura M. López-Sánchez1, MªTeresa Cano2, Juan de la Haba-Rodríguez2, Chary López-Pedrera1, Antonio Rodríguez-Ariza1, Enrique Aranda2.

1Unidad de Investigación y 2Servicio de Oncología Médica, Hospital Universitario Reina Sofía, Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba, IMIBIC, Córdoba, Spain,

(aracelivalverde_es@hotmail.com)

MATERIAL Y MÉTODOS

OBJETIVO

El sistema de señalización EGFR-KRAS-BRAF podría ser esencial para el establecimiento y mantenimiento de las células tumorales. BRAF es la molécula efectora del gen KRAS, en una vía de señalización implicada en la proliferación celular y la supervivencia. Tanto KRAS como BRAF, son genes frecuentemente mutados en los carcinomas colorrectales esporádicos. Pacientes con cáncer colorrectal avanzado, con tumores con una mutación en los genes KRAS o BRAF no se benefician de las terapias por anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), como cetuximab y panitumumab. Por tanto, se necesitan otras terapias dirigidas. AEE788 es un inhibidor de tirosina quinasa multidiana, con una potente actividad inhibitoria contra EGFR y el receptor del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGFR). El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia de AEE788 para inhibir la proliferación celular en células de cáncer colorrectal con diferentes estados mutacionales RAS/BRAF, y también explorar los mecanismos implicados.

Las líneas celulares humanas de cáncer colorrectal SW48 (KRAS/BRAF no mutado), Caco-2 (BRAF V600E) y HCT-116 (KRAS G13D) se trataron con diferentes dosis de AEE788, en presencia o ausencia de EGF o VEGF. La proliferación celular se midió mediante un ensayo XTT. La apoptosis se determinó utilizando tanto la detección de muerte celular por ELISA, como el análisis de citometría de flujo con anexina V. Los niveles de expresión y la fosforilación de EGFR, VEGFR, Akt y ERK1 / 2, y la expresión de la COX-2 se determinaron mediante Western-blot con los anticuerpos específicos correspondientes.

A)

B)

Figura 1.Inhibición de la proliferación en células de cáncer colorrectal por AEE788. La proliferación celular se analizó a las 72 h del tratamiento con diferentes dosis de AEE788 (A). La inhibición de la proliferación dependiente de EGF se ensayó creciendo las células en ausencia y en presencia de EGF (100 ng/ml) y en presencia o ausencia de AEE788 2,5 µM (* p <0.05) (B).

RESULTADOS

AEE788 inhibió de manera efectiva la proliferación de las células Caco-2 en formas dosis-dependiente (Fig1A). Por otra parte, AEE788 fue capaz de reducir la proliferación celular dependiente de EGF en células SW48 y Caco-2, pero no en la línea celular HCT-116 (Fig. 1B). En las tres líneas celulares, AEE788 inhibió la fosforilación de EGFR inducida por EGF, y esta inhibición estuvo asociada a la inhibición de las quinasas intracelulares Akt y ERK1 / 2 en células Caco-2 (Fig. 2). En concordancia con estos resultados, AEE788 indujo de manera más eficiente la apoptosis en Caco-2, cuando proliferaban en presencia de EGF, en comparación con las líneas celulares SW48 y HCT-116 (Fig. 3). Significativamente, AEE788 redujo la proliferación celular dependiente de VEGF en la línea celular Caco- 2 (Fig. 4A), y este efecto antitumoral se asoció a la inhibición de la fosforilación de la quinasa ERK 1 / 2 cuando estas células crecieron en presencia de VEGF (Fig. 4B). La expresión de VEGF y VEGFR2 puede depender de los niveles de expresión de la ciclooxigenasa-2, y el efecto anti-VEGF de AEE788, se relacionó con la eficiente expresión de esta enzima en células Caco-2, mientras que en células SW48 ó HCT-116 fue muy baja o indetectable (Fig. 4C).

Figura 2. Inhibición de EGFR y de las quinasas de señalización intracelular por AEE788 en células de cáncer colorrectal. Las formas fosforiladas y no fosforiladas de EGFR, ERK 1/2 y AKT se detectaron mediante Western-blot. Las células se crecieron en ausencia o presencia de EGF (100 ng / ml) y se trataron con AEE788 2,5 µM. En cada caso se incluye el nivel de expresión de la β-Actina como control de carga.

B)

*

Figura 3.AEE788 ejerce efectos apoptóticos en células de cáncer colorrectal. La fracción de células apoptóticas se estimó después del tratamiento con diferentes dosis de AEE788. Las células se crecieron (48 h) en ausencia (suero fetal bovino al 1%) (A) o en presencia de EGF (100 ng / ml) (B).

B)

A)

C)

*

CONCLUSIONES

AEE788 ejerce efectos anti-proliferativos y apoptóticos en células de cáncer colorrectal con BRAF mutado, mediante la inhibición de la señalización intracelular dependiente de EGF y VEGF. Nuestros resultados apoyan que AEE788 puede ser eficaz en el tratamiento del cáncer colorrectal en un contexto KRAS no mutado, independientemente del estado mutacional de BRAF

(µM AEE788)

  • Figura 4. Inhibición de la proliferación dependiente de VEGF por AEE788 en células de cáncer colorrectal. La proliferación celular dependiente de VEGF fue ensayada después de 48 h de tratamiento con diferentes dosis de AEE788 (* p <0.05) (A). La fosforilación de ERK 1/2 en células Caco-2 cultivadas en presencia de VEGF (100 ng / ml) y tratadas con AEE788 se analizó mediante Western-blot. Se incluye el nivel de expresión de la β-Actina como control de carga (B). Se analizaron por Western-blot los niveles basales de expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) en células Caco-2, HCT-116 y SW48 Se incluye el nivel de expresión de la β-Actina como control de carga (C).