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分子生物学实验

分子生物学实验. 实验目录. 碱裂解法小量制备质粒 DNA 2. 感受态细胞制备 3. 质粒转化 4. 聚合酶链式反应（ PCR ）. 实验一. 碱变性法小量制备质粒 DNA. 一、实验目的. 掌握碱裂解法提取质粒的方法. 二、实验原理. 分离质粒 DNA 方法. 碱变性法 煮沸法 SDS 法 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高 , 提取的质粒 DNA 可用于酶切 , 连接与转化. 碱变性法基本原理.

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分子生物学实验

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Presentation Transcript

  1. 分子生物学实验

  2. 实验目录 • 碱裂解法小量制备质粒DNA • 2.感受态细胞制备 • 3.质粒转化 • 4.聚合酶链式反应（PCR）

  3. 实验一 碱变性法小量制备质粒DNA

  4. 一、实验目的 • 掌握碱裂解法提取质粒的方法

  5. 二、实验原理

  6. 分离质粒DNA方法 • 碱变性法 • 煮沸法 • SDS法 • 羟基磷灰石层析法等 • 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化

  7. 碱变性法基本原理 • 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 • 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA

  8. 三、实验材料

  9. 实验试剂 • ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH7.5 NaCl 10g • ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA • ＡｍＰ 50mg/ml • 溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）

  10. 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA

  11. 四、实验方法 • １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度 • ２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀 • ３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟

  12. 四、实验方法 • ４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物，冰上放置5分钟 • ５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟 • ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中 • ７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中

  13. ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。 • ９．12000g ,4 ℃离心５分钟。 • 10．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000g 4 ℃离心２分钟。 • 11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 • 12．加入50μl TE（含20μg/mlRNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。

  14. 13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比 14.同时以以下公式计算得率 质粒DNA得率： 稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml 15．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。 16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果

  15. 五、实验结果分析 • １．根据质粒DNA OD260,OD280值，计算质粒DNA得率和DNA纯度 • ２．记录电泳结果并说明结果内容

  16. 六、思考题 • １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因 • ２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因

  17. 大肠杆菌感受态细胞制备 实验二

  18. 实验目的 • 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法

  19. 实验原理 • 感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态 • 细菌经低渗氯化钙处理后，细胞膨胀、细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过细胞的状态 • 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态

  20. 实验仪器

  21. 超净工作台

  22. 台式高速冷冻离心机

  23. 恒温空气摇床

  24. 实验试剂 • 大肠杆菌DH5α • LB培养基， • 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）

  25. 实验步骤 • 菌株活化 • 感受态细胞制备

  26. 实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4

  27. 感受态细胞制备 4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5．6000rpm离心10min,弃上清 6．加入0.3ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 7．4000rpm离心5 min,弃上清 8．加入0.2ml预冷含有甘油的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即为感受态细胞，可－70℃长期保存

  28. 思考题 1.常用制备感受态细胞的大肠杆菌有哪些 2. 第8步中氯化钙溶液中甘油的作用是什么

  29. 氯化钙诱导质粒转化 实验三

  30. 实验目的 • 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义 • 2.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法

  31. 转化 • 将外源 DNA 分子引入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术

  32. 常用转化方法 • 电击法 • CaCl2、RuCl等化学试剂法

  33. 实验原理 • 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，加入 pUC18质粒，在钙离子的作用下，质粒与钙离子形成复合物吸附在细菌细胞表面，经42℃短暂热刺激，细胞膜通透性增大，可吸收吸附的质粒DNA，即实现转化

  34. 实验原理 • pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，接受该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性。将转化后的受体细胞于含氨苄青霉素平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡

  35. 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基

  36. 影响转化率的因素 • 细胞生长状态和密度 • 转化的质粒DNA质量、浓度 • 试剂的质量 • 防止杂菌和其它外源DNA污染

  37. 实验仪器

  38. 超净工作台

  39. 台式高速冷冻离心机

  40. 恒温空气摇床

  41. 恒温培养箱 培养皿

  42. 实验试剂 • 感受态细胞大肠杆菌DH5α • LB培养基， • 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） • 氨苄青霉素 • pUC18质粒

  43. 实验步骤 1. 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 2. 于42℃水浴90S 3. 冰上放置2min 4. 加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时

  44. 实验步骤 5. 3000rpm离心2min 6. 吸出上清液0.8ml，将剩余液体轻轻吸打、混合均匀 7. 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 8. 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果

  45. 对照组 • 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现 • 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落

  46. 转化率 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

  47. 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

  48. 实验结果

  49. 思考题 • 分子生物学中常用的载体有哪些 • 实验步骤第4步加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时的作用是什么

  50. 实验四 聚合酶链式反应（PCR）

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