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青枯雷尔氏菌致病力 分化的研究

青枯雷尔氏菌致病力 分化的研究. 导 师 : 刘波 答 辩 人 : 程本亮 专 业 : 微生物学. 1. 前言. 2. 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化. 3. 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化. 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理. 4. 5. 内容提要. 青枯雷尔氏菌无致病力突变株的生物学异质性. 1 、 前言. Ralstonia solanacearum. 病原. 烟草、番茄、茄子等 50 多科的 400 多种植物 。. 寄主. 热带、亚热带地区；在我国，主要发生在长江以南地区. 分布.

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青枯雷尔氏菌致病力 分化的研究

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Presentation Transcript

  1. 青枯雷尔氏菌致病力分化的研究 导 师: 刘波 答 辩 人: 程本亮 专 业: 微生物学

  2. 1 前言 2 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 3 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4 5 内容提要 青枯雷尔氏菌无致病力突变株的生物学异质性

  3. 1、前言 Ralstonia solanacearum 病原 烟草、番茄、茄子等50多科的400多种植物。 寄主 热带、亚热带地区；在我国，主要发生在长江以南地区 分布 轮作、培育抗性品种、化学农药和生物防治 防治 Ralstonia solanacearum

  4. 1、前言 无致病力青枯雷尔氏菌 青枯病生物防治 • 根据对不同寄主致病性的表现进行划分，分为生理小种1～4。 • 根据对3种糖和3种醇的氧化能力分为生化型I～V。 • 除此之外，还有血清型、溶原型以及致病型和菌系等种下分化的分类方法。

  5. 无致病力菌株 强致病力菌株 健康植株 发病初期植株 发病后期植株 2、不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 2.1 番茄植株中青枯雷尔氏菌的分布及致病力分化 • 发病初期的植株只有根部分离到青枯菌。在发病后期的植株的根、茎基、茎中部均有分离到青枯菌，其中茎基的青枯菌浓度最高。 • 在初期的根部和发病后期的茎中部位分离到少量无致病力青枯雷尔氏菌。

  6. 2、不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 2.2 花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化 • 只在青枯病发病初期、中期和后期的植株的根、茎基部分离到青枯菌，而且全部为强致病力菌株。 • 青枯菌的浓度随病情指数增加而增大。

  7. 菌脓 强致病力菌株 水渍状 无致病力菌株 2、不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 2、不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 2.3 生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化

  8. 2、不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 2.4 小结 • 从番茄青枯病发病初期的病株根部和青枯病发病后期的病株茎中部分离到的青枯菌中除了强致病力的菌株外，还分离到少量无致病力的菌株，分别占2.5％和2.2％， • 从生姜病株的茎部分离到的青枯菌均为无致病力的菌株，而花生植株中未分离到无致病力青枯雷尔氏菌。 • 结果表明青枯雷尔氏菌在自然条件下在不同作物的不同部位存在不同致病力的分化。

  9. 青枯菌 5ml 24h后 5ml BC-0711 3、生防菌作用下青枯菌致病力分化的研究 3.1 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化 实验方法：

  10. Rs1100无菌水对照 GMI1000无菌水对照 GMI1000生防菌处理 Rs80生防菌处理 3、生防菌作用下青枯菌致病力分化的研究 3.1 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化 Rs91无菌水对照 Rs80无菌水对照 无致病力菌株（14.3％） Rs91生防菌处理 Rs1100生防菌处理

  11. 生防菌处理的第1代Rs91 生防菌处理前的Rs91 生防菌处理的第2代Rs91 生防菌处理的第3代Rs91 3、生防菌作用下青枯菌致病力分化的研究 3.2 生防菌持续作用下青枯菌Rs91的致病力分化 生防菌与青枯雷尔氏菌Rs91通过3代连续处理后的菌株的致病力均未发生变化。 结果表明生防菌BC-0711对青枯雷尔氏菌Rs91没有致弱作用。 生防菌BC-0711对Rs1100的致弱现象是怎么产生的呢？

  12. 第5代Rs91 第2代Rs91 无致病力菌株（5.6％） 第5代Rs1100 第2代Rs1100 3、生防菌作用下青枯菌致病力分化的研究 3.3 青枯菌Rs91和Rs1100继代培养过程中的致病力分化 为研究生防菌BC-0711对青枯菌致病力分化的关系对青枯雷尔氏菌Rs91和Rs1100进行连续5代的继代培养。 青枯雷尔氏菌Rs91在连续5代继代培养条件下未出现致病力的分化。 Rs1100在继代至第5代时，出现无致病力青枯雷尔氏菌菌落。

  13. 3、生防菌作用下青枯菌致病力分化的研究 3.4 小结 • 当生防菌BC-0711处理致病力不稳定的青枯雷尔氏菌时，由于生防菌对青枯雷尔氏菌不同致病力的菌株的抑制作用存在差异，因此生防菌的抑制作用为青枯雷尔氏菌的分化提供了一个选择压力，因此青枯雷尔氏菌致病力分化现象较继代培养更早的出现，且比例更高，表现为致弱现象。 • 而当生防菌BC-0711处理致病力稳定的青枯雷尔氏菌时，由于其自身不存在致病力分化，因此生防菌对其只有抑制作用，而没有致弱作用。

  14. 电击转化，筛选 青枯菌Rs91 感受态细胞 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.1 青枯雷尔氏菌的Tn5转化 试验方法：

  15. 4.2Rs91与突变株菌落形态比较 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 Rs91

  16. 700bp 700bp 4.3 突变株Kanr基因检测 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 选取40株突变株PCR 扩增 681bp 的卡那霉素抗性（ Kanr）基因。 引物为 P1: 5′-GGTGCGACAATCTATCGA-3′ P2: 5′-CTCATCGAGCATCAAATG-3′

  17. 700bp 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.4 突变株遗传稳定性测定 试验方法：利用引物检测继代前和继代后菌株的KanR基因以及对继代后菌株在抗性平板和非抗性平板上的菌落数来判断突变株的遗传稳定性。 泳道2－11为继代前菌株；泳道12－21为对应的继代后菌株

  18. 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.4 突变株遗传稳定性测定 继代后的最后一代菌株稀释后，涂布于TTC平板和含卡那霉素的TTC平板上的菌落数无显著差异。表明Tn5突变株具有很高的遗传稳定性。

  19. 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.5 无致病力突变株致病力测定

  20. 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.6 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点 表2 无致病力突变株T2、 T4、T5 、T7和T8的转座子插入位点

  21. 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.6 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点测定 无致病力突变株T2插入位点侧翼序列测序结果：

  22. 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.6 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点

  23. 4、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 4.7 小结 • 通过Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)获得1004株转座子随机插入突变株，经过在TTC平板上的形态特征筛选,其中有13株突变株具有无致病力青枯雷尔氏菌的形态特征。 • 对其中5株无致病力突变株进行反向PCR测序和序列比对，分析鉴定出这5株青枯雷尔氏菌突变株的插入位点在phcA基因和phcS基因上，经番茄盆栽苗致病力检测,确定为无致病力菌株。

  24. 5、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性 5.1 初始pH值对无致病力突变株生长的影响 pH值对Rs91和无致病力突变株T2、T4、 T5、T7和T8的影响的比较

  25. 5、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性 5.2 培养温度对无致病力突变株生长的影响 青枯菌生长判别：“－”不生长；“+”生长较差；“++”生长较好；“+++”生长旺盛 表3 温度对无致病力突变株生长的影响

  26. 5、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性 5.3 无致病力突变株生长曲线异质性 5株突变株进入对数生长期后的增长速率均显著小于原始菌株，进入稳定期后的菌量与原始株也存在显著差异。

  27. 5、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性 5.4 无致病力突变株胞外多糖含量异质性 原始菌株Rs91的相对胞外多糖含量为28.45μg/OD600，无致病力突变株的相对胞外多糖含量则显著降低，为11.81μg/OD600 －17.59μg/OD600

  28. 5、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性 5.5 无致病力突变株TTC液体培养基分光光度计吸收峰分析 无致病力突变株的吸收光谱曲线与原始菌株Rs91的趋势一致，但是无致病力突变株的吸收光谱曲线均位于野生株上方 。

  29. 5、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性 5.5 无致病力突变株TTC液体培养基分光光度计吸收峰分析 TTC培养基发酵液聚类分析结果 通过聚类分析发现，当λ＝3.06时将Rs91、phcA基因突变株和phcS基因突变株聚为三类，分别是野生株Rs91为第I类,phcA基因突变株聚为第II类，phcS基因突变株为第III类

  30. 5、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性 5.6 小结 • 比较了这5株突变株与原始菌株的生理生化特性，这5株突变株的生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91，但最适pH值和最适温度未发生变化。 • 5株突变株TTC液体培养基上清液在紫外-可见分光光度计上于400-450nm波长上吸收峰的扫描结果通过聚类分析发现这5株突变株与原始菌株Rs91分别聚为不同的三类，即Rs91为第I类，phcA基因突变株为第II类，phcS基因突变株为第III类。

  31. 致 谢 • 感谢我的导师刘波研究员对我的精心指导，不仅培养了我的专业能力，还教会我很多为人处世之道； • 感谢实验室的车建美在试验和论文撰写过程中给予的指导和帮助； • 感谢实验室的工作人员和同学们对我试验和生活上的帮助。

  32. 谢谢！

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