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Patrice Crété Laboratoire de Génétique et Biophysique des plantes crete@univmed.fr. La transgenèse végétale: principes et applications. la transgenèse végétale 1. La transgenèse végétale : un outil de la biotechnologie issu de la recherche fondamentale. Biotechnologie

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Presentation Transcript
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Patrice Crété

Laboratoire de Génétique et Biophysique des plantes

crete@univmed.fr

La transgenèse végétale: principes et applications.

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la transgenèse végétale 1

La transgenèse végétale : un outil de la biotechnologie issu de la recherche fondamentale

  • Biotechnologie
    • Ensemble de techniques biologiques, provenant de la recherche fondamentale, qui sont appliquées à la recherche et au développement de produits.
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la transgenèse végétale 2

Principes de la transgenèse végétale

Utilisation de la transgenèse végétale :

En recherche fondamentale

En recherche appliquée

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la transgenèse végétale 3

Principes de la transgenèse végétale

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la transgenèse végétale 4

Certaines bactéries infectent les cellules végétales et provoquent des tumeurs ou proliférations cellulaires chez les plantes infectées

La galle du collet (crown gall ou « cancer des plantes » )

Viticulture, sylviculture  problèmes

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la transgenèse végétale 5

Smith et Townsend montrent en 1907 que le crown-gall est causé par une bactérie Agrobacterium tumefaciens

Comment la bactérie entraîne une multiplication incontrôlée des cellules végétales ?

Réponse trouvée par la découverte des hormones végétales et de l’utilisation de la technique de culture in vitro

Deux familles d’hormones permettent aux cellules végétales de se multiplier indéfiniment en culture in vitro

Les auxines et les cytokinines

Cellules végétales non infectées + auxines + cytokinines

Formation de cals

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la transgenèse végétale 6

Propriétés des cellules de la tumeur

Braun montre en 1943 que les cellules de la tumeur peuvent se multiplier indéfiniment en absence de bactéries et en absence de substances de croissance (auxines, cytokinines ).

Prélèvement de cellules

de la tumeurs et mise en culture in vitro en absence d’auxines et de cytokinines

Productions de cals

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la transgenèse végétale 7

Propriétés des cellules de la tumeurs

sans ajout d’hormones

ADN-T = ADN de transfert = ADN venant de la bactérie et intégré dans le génome des cellules végétales

ADN-T contient des gènes qui s’expriment dans les cellules infectées et qui permettent de produire des auxines et des cytokinines d’où une augmentation anormale des quantités d’hormones

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la transgenèse végétale 8

D’où vient l’ADN de transfert ou ADN-T ?

Les agrobactéries hébergent de très grands plasmides (200 kb) nécessaires à la formation des tumeurs

ADN circulaire extrachromosomique, autonomie de réplication, plusieurs exemplaires par cellule, plasmide appelé Ti pour Tumor inducing

organisation du plasmide Ti d’A. Tumefaciens

Vir = région qui contient les gènes de virulence

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R

la transgenèse végétale 9

Système de transformation binaire

Description du vecteur binaire ( 10 à 12 Kb)

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BD

BG

la transgenèse végétale 10

Les étapes de la transformation génétique du tabac

Totipotence chez les végétaux: aptitude pour une cellule végétale à exprimer la totalité des potentialités du génome pour donner un organisme entier

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la transgenèse végétale 11

Rôle des auxines et des cytokinines dans l’organogenèse

Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture,

Notion de balance hormonale

En concentrations égales  division de cellules indifférenciées = cals Auxine  formation de racines

Cytokinines  bourgeons

Indole ButyricAcid (IBA)

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la transgenèse végétale 12

transformation

Cellules

Disques foliaires

ou OGM ou PGM

Transmission de l’ADN-T à la génération d’après

Intégration aléatoire dans le génome

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la transgenèse végétale 13

Transformation par électroporation de protoplastes

Cellules débarrassées de leur paroi, par traitement enzymatique (cellulases)

Nagata et Takebe, 1970

Peuvent se diviser (suivant les conditions) et régénérer des plantes entières

Electroporation de l’ADN-T, pas de bactérie : transformation puis régénération de plantes transgéniques

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la transgenèse végétale 15

Production de plantes transgéniques d’Arabidopsisthaliana

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la transgenèse végétale 16

Transformation génétique d’Arabidopsis thaliana par infiltration

Stade préfloral

Donc au moment de la formation des ovules et du pollen

4 semaines

Intégration de l’ADN-T dans l’ovule à différents stades (intégration dans du pollen très rare)

(0,1 à 3%)

Lors de la génération d’une plante transgénique, l’ADN s’insère dans un seul des chromosomes homologues.

Pas de locus correspondant sur l’autre chromosome -> hétérozygote

La moitié des gamètes porteront le transgène

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la transgenèse végétale 17

Applications de la transgenèse végétale

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la transgenèse végétale 18

Applications en recherche fondamentale

2 exemples

1) Étude de l’activité d’un promoteur

2) Recherche de la fonction d’un gène par modification de

son expression (sur ou sous)

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la transgenèse végétale 19

1) Étude de l’activité d’un promoteur

Le gène marqueur de la B-glucuronidase de E.coli (GUS)

BLANC

BLEU

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Promoteur A

GUS

la transgenèse végétale 20

1) Étude de l’activité d’un promoteur

- Détails de la construction

- Observations

Promoteur A

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la transgenèse végétale 21

2) Recherche de la fonction d’un gène par modification de son expression

A) Sur-expression

Détails de la construction

Plante transgénique sur exprimant un gène  implication dans la formation du méristème

Plante sauvage

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la transgenèse végétale 22

B) Sous-expression

Stratégie antisens, détails de la construction

Plante sauvage

Plante transgénique sous exprimant un gène  implication dans l’architecture foliaire

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la transgenèse végétale 23

Applications de la transgenèse végétale

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la transgenèse végétale 24

Nombreux domaines d’application

Agriculture

Agroalimentaire

Industries

Environnement

Santé-pharmacie

Introduction de caractéristiques nouvelles et production de molécules d’intérêt

Le code génétique est universel, pas de barrière d’espèces

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la transgenèse végétale 25

Agriculture

Résistance aux herbicides, aux insectes et contre certains virus et bactéries

Résistance à la pyrale

  • Par endotoxine (insecticide naturel) de Bacillus thuriengensis (Bt) contre larve de lépidoptère (Pyrale)
  • protoxine clivée dans l’intestin de l’insecte par protéase + pH alcalin
  • Toxine active qui se fixe à des sites de l’intestin
  • ulcération, perte d’appétit
  • Rupture des cellules, mort des larves

Moins d’insecticides chimiques, maïs, tomate, pomme de terre, coton, laitue, peuplier,

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la transgenèse végétale 26

Agriculture

Résistance aux stress (chaleur, froid, sécheresse et salinité)

Agroalimentaire

Introduction de caractères pour obtenir des avantages nutritionnels, gustatifs

Riz doré (golden rice)

carence en vitamine A (antioxydant), 400 millions de personnes (cécités, sensibilité accrue aux infections)

Introduction de 4 gènes  synthèse de B-carotène (précurseur de la Vit A)

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la transgenèse végétale 27

Industries

Industrie papetière, papier à partir de cellulose du bois,

Présence de lignine, imperméable et inextensible  très coûteux à éliminer et source de pollution (utilisation de chlore et consomme une très grande quantité d'eau)

Diminution du taux de lignine par transgenèse

Coton génétiquement modifiées pour obtenir des vêtements en fibres naturelles moins froissables ou des cotons colorés qui éviteront l'utilisation de teintures nécessitant de nombreux contrôles et des systèmes d'épuration des eaux usées des teintureries lourds et coûteux à mettre en place.

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la transgenèse végétale 28

Industries

Biocarburants

Huile de Colza

De nouvelles variétés de colza ont été obtenues par transgenèse pour diminuer la viscosité et augmenter l'indice d'octane du diester.

Actuellement les huiles représentent seulement 43 % de la masse des graines de colza. Des recherches sont menées pour accroître ce rendement. Le gène qui code l'enzyme intervenant dans la dernière synthèse de l'huile a été isolé. Des copies supplémentaires de ce gène ont été introduites dans du colza. Certaines graines ont ainsi produit une quantité d'huile correspondant à plus de 75 % de leur masse.

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la transgenèse végétale 29

Santé-pharmacie

Production de vaccins, d’anticorps, de protéines (hémoglobine…)

Avantage des cellules végétales

Plante alternative intéressante comparée aux microorganismes ou aux cellules des mammifères

Machinerie cellulaire complexe et sophistiquée

Les protéines humaines subissent des modifications post traductionnelles (glycosylation, carboxylation, lipidation) nécessaire à leur activité biologique

Ces modifications possibles chez les plantes, difficiles voir impossible chez les bactéries ou levures

Plantes non porteuses des agents pathogènes couramment associés aux infections humaines (virus, bactéries)

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la transgenèse végétale 30

Avantage des cellules végétales

Leur contenu cellulaire, hormis la protéine recombinante, connu de l’homme par son utilisation dans l’alimentation, en cosmétique et en pharmacie.

- Stockage stable des protéines recombinées dans des endroits stratégiques de la plante (tubercule, feuilles, graines, fruits…)

- Facilite l’extraction et la purification

  • Si protéine recombinante administrée par voie orale, consommation
  • directe de la plante possible

Les plantes peuvent être propagées à l’infini

Leur production à grande échelle ou en conditions contrôlées fait partie du patrimoine culturel de toutes les nations

Biomasse la moins onéreuse à produire à ce jour par unité de volume

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la transgenèse végétale 31

Santé-pharmacie

Exemples de molécules obtenues

Molécules plasmatiques, albumine humaine (HSA) Remplacement d'éléments sanguins (sang "artificiel"), coût de production 5 fois moins élevé que si albumine purifiée à partir du plasma, pas de contaminations

Hémoglobine humaine produite à partir de tabac transgénique l'hémoglobine (des biologistes français ont déposé une demande de brevet)

Lactoferrine Humaine: protéine multifonctionnelle du lait à activités anti-bactérienne, anti-fongique et anti-virale. (attente d’autorisation de mise sur le marché)

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la transgenèse végétale 32

Santé-pharmacie

Exemples de molécules obtenues

Collagène, phase de développement, soigner l'arthrose et aider à la réparation des tissus en cas de chirurgie ou traumatismes

Hirudine, puissant inhibiteur de la thrombine utilisée comme anticoagulant, source naturelle la sangsue, production dans graines de colza transgénique,

Production de vaccins

- Vaccins dit « comestibles »

Choléra, production de la sous unité de la toxine dans la pomme de terre

Rage: glycoprotéine du virus produit par la tomate

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la transgenèse végétale 33

Santé-pharmacie

Exemples de molécules obtenues

Production de vaccins

La prochaine pandémie (épidémie planétaire) pourrait être d’origine aviaire (si virus de la grippe aviaire H5N1 muté très contagieux pour l’homme)

Vaccin basé sur l’inoculation du virus de la grippe humaine dans des œufs fertilisés ou embryonnés, puis purification du virus et inactivation

pour fabriquer 1,2 milliard de doses, il est nécessaire de disposer de... 4 milliards d’oeufs embryonnés et d’au moins six mois au minimum.

Il faut aussi des œufs exempts de virus

Une autre solution ?  la production chez les plantes

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Production de ("VLP") Virus-Like Particle dans des plants de tabac pour faire un vaccin contre le virus H5N1

Et pourquoi pas H1N1

Expression transitoire pour production à grande échelle en utilisation des agrobactéries infiltrées dans les feuilles de tabac