实验三拮抗作用的皿内测定

实验三拮抗作用的皿内测定 一、实验目的 • 1. 掌握生防菌皿内测定的基本原理及操作方法 • 2. 观察不同类型的生防菌对植物病原菌的抑制作用，学习生防效果的测定与计算方法。二、实验原理在皿内平板上，将生防菌与病原菌接种在平板上，采用平板对峙法实验，观察生防菌对病原菌的拮抗活性。观察生防菌的防治作用，如抑菌作用、竞争作用、重寄生、嗜菌与溶菌作用、促生作用等。

三、实验材料和仪器 1. 常用的供试靶标菌：产孢的丝状病原真菌：14种 • 稻瘟病菌 (Pyricularia oryzae Cav.) • 小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum） • 小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana） • 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis（Sacc.）Arx & Olivier） • 小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis) • 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum (Pass.)Leonard et Sugges） • 棉花枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum） • 棉花黄萎菌(Verticillium dahliae Kleb)

苹果炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides ) • 番茄叶霉病菌（Fulria fulva（Cooke）Ciferri） • 番茄枯萎病菌(Fusarium.oxysporium f.sp.cinerea) • 番茄早疫病菌（Alternaria solani（Ellis et Martin）Jones et Grout） • 番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea ） • 立枯丝核菌（Rhizoctonia.solani） • 黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonospron cubensis） • 蒜叶枯病病菌（Macrosporum commune） • 辣椒炭疽病病菌（Colletotrichum） • 烟草赤星病菌（Alternaria alternata(Fries)Keissler）

非产孢丝状真菌：难产孢或不产孢真菌2种： • 油菜菌核病菌（Slerotinia sclerotiorum） • 水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）

供试靶标细菌： • 枯草杆菌（Bacillus subtilis） • 茄青枯病菌(Burkholderia solanacearum) • 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium） • 水稻白叶枯（Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Ishiyama)） • 黄瓜细菌性角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.lachryrnas(Smith et Bryan) • 马铃薯环腐病（Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicum） • 白菜软腐病(Erwinia carotovora var.Carotovora )

四、实验操作 1. 靶标菌的培养（提前1周准备） • 将靶标真菌接种在PDA培养基，25℃下用扩繁3-7天后，备用。 • 挑取细菌单菌落接种40毫升KB培养液中，置于28℃下150转∕分的摇床上发酵培养8小时。

3. 试剂与培养基： 70%酒精、浮载剂。 • PDA培养基：去皮马铃薯 200克，葡萄糖 20克，琼脂 10克，水 1000 毫升。 • KB培养液：蛋白胨 20.0克，KH2PO4 1.5克，MgSO4·7H2O 1.5克，甘油 10.0克，水 1000毫升，pH=7.2。 4. 实验用具及仪器：无菌培养皿、打孔器、接种针、酒精灯、镊子、三角玻璃刮铲、移液枪、吸管等。

2. 生防微生物的准备（提前1周准备） A.沾取灭菌水，挑取放线菌菌落直接划线培养或制备菌悬液涂抹接种，纯化培养1周。 B.放线菌：28℃下150转∕分的摇床上发酵培养3-5天。提取发酵产物，备用。 C. 挑取拮抗细菌单菌落接种40毫升KB培养液中，置于28℃下150转∕分的摇床上发酵培养48小时。

拮抗放线菌菌株的筛选程序如下： 拮抗放线菌菌株初筛试验温室盆栽复筛发酵液平板法琼脂平板法单孢分离真菌（十字交叉法）细菌（浇混平板）生长速率法复筛测定测试防病效果及防效稳定性

3. 靶标真菌的平板对峙测定 a. 制备菌饼待拮抗菌、靶标菌布满平皿后，用打孔器打取直径7mm病原菌菌块。靶标菌各60-100块，拮抗菌根据需要打取。如果是发酵液则用7mm的打孔器打孔，注入发酵液上清液100μL。 b. 处理按照A、B、C方式加样（见下图）。不接生防菌的平板为对照。 c. 标记菌种名称，注明日期、学生姓名，然后置于25℃培养箱中培养。

处理C 处理B 4厘米 4厘米平板：12毫升PDA培养基生防菌：菌饼1块或100微升菌液靶标菌：病原真菌

处理A 对照 4厘米平板：12毫升PDA培养基生防菌：菌饼1块或100微升菌液靶标菌：病原真菌

S. rolsfii P. aphanidermatum F. melonis R. solani Control IC1270 Control IC1270 靶标菌： S. rolsfii、 F. melonis、P. aphanidermatum 、R. solani 生防菌： IC1270

Waksman agar Antagonistic bacteria Fungi

Bacteria with antagonistic activity towards Fusarium oxysporum negative

Positive to anti-Pythium Negative

Positive to anti-V.dahliae Negative to anti-V.dahliae

4. 靶标细菌的平板测定 以环腐病菌作为指示菌，利用平板扩散法，进行测定。（1）在超静工作台上，将约109cfu/ml的环腐病菌悬液0.2 ml加入灭菌培养皿中，（2）然后倒入已冷却至40℃左右的培养基20 ml，充分摇匀。（3）冷却后，点上生防菌。（4）放在22℃～25℃温箱中培养3～4d，检查抑菌圈的有、无及大、小情况。

5. 抗病物质纯品活性的测定 （1）制备含有抗病物质浓度为0、0.005、0.1、0.5、1、5、10、100、500、1000ug/ml的PSA平皿；（2）分别移入各菌株菌饼（在PSA上预培养培养24小时），在22℃下培养48小时。（3）测量菌落直径；（4）计算药物各浓度下对菌丝的抑制率。按浓度对数--抑菌率值法计算各菌株毒力回归方程和EC50值，并计算抗性菌株的抗性指数（RR）。抗性指数： 10-20为中抗 20-100为高抗 100以上为极高抗水平。

6. 重寄生现象观察 a.在PDA平板上用涂抹法接种靶标病菌，置于25℃培养箱中培养2-3天，待靶标致病菌布满培养皿。 b.将准备好的生防菌菌悬液吸取0.5ml滴于皿内，用三角玻璃刮铲均匀涂布于致病菌菌落上，继续在25℃温箱中培养一周。以不接生防菌为对照。 c.待靶标菌菌落上出现生防菌菌落时，刮去气生菌丝，挑取少许营养菌丝制片，镜检，观察致病菌丝被寄生现象。 d.对观察到生防菌寄生于靶标致病菌的玻片进行显微照相。

7. 发酵滤液抑菌作用的测定 一、培养基　 1. 病原真菌用PDA培养基。 2. 放线菌菌株培养液:葡萄糖10g，蛋白胨3g,NaCl2.5g,黄豆饼浸汁原液(1%浓度)1000ml。二、发酵滤液的制备　 1. 将菌株用黄豆粉培养基培养。装液量为80-100mL/250 mL三角瓶，灭菌后, 每瓶接入1m 种子菌液, 28℃、180r/min、黑暗振荡培养7d ，或30℃及180r/min 的摇床上培养72h, 。 2. 提取菌株培养液， 6000r/min- 12000r/min离心15min，除去菌体沉淀后，制得无菌滤液。三、发酵滤液抑菌谱的测定　在无菌条件下, 用吸管吸取3mL 发酵滤液于培养皿内, 加入融化的PDA 培养基7mL 混合均匀。冷却后分别接入供试的20种病原菌菌丝块。每种病原菌处理均设3次重复, 以无菌水代替发酵滤液为对照, 置于28℃培养。

Cultivation of Actinoplanes friuliensis in the bioreactor. (Photo: Esslingen University of Applied Sciences)

发酵培养

四、发酵滤液对病原真菌的作用 • 将菌株发酵滤液分别稀释至2、4、8、16、32倍，制成不同浓度的测试液。取玉米小斑菌、番茄灰霉菌、莴笋霜霉菌孢子悬浮液(孢子浓度1×105cell／ml)；玉米小斑菌的菌丝段悬浮液（打碎菌丝体，长度约50um，浓度1×103 cell/ml）及抑菌液各20ul，滴置于载玻片上混匀后置于保湿的培养皿中[1]，25℃培养，每个处理重复3次。每个浓度均每隔2、4、6、8、12、14、16、18、20 h，分别于光学显微镜下观察孢子萌发情况(包括孢子萌发、芽管长度、菌丝生长)。以未加发酵滤液的孢子和菌丝段悬浮液作为对照。

五、实验结果的观察、调查与作业 1. 培养1周后，测量生防菌菌落边缘与靶标菌菌落边缘的垂直距离、抑菌圈半径，观察病原菌落的光滑程度等。绘图，加注说明。计算抑菌率。

待对照菌落长满全皿后用十字交叉法测量菌落直径,求出毒力回归方程,并计算供试药剂对病原菌的有效中浓度( EC50 ) 。

斑点杀菌法 • 【试剂】 • 1%琼脂糖、0.03%营养肉汤粉、10mmol/l PH值5。5的柠檬酸-磷酸二氢钠、对数生长期细菌（105个/mL） • 【器材】9*9cm的正方形塑料平皿，锥形瓶，37℃孵箱 • 【步骤】 • 在9*9cm的正方形塑料平皿倒一层底层琼脂（含1%琼脂糖、0.03%营养肉汤粉、10mmol/l PH值5.5的柠檬酸-磷酸二氢钠、对数生长期细菌（105个/mL） • 在底层琼脂上打直径3mm的圆孔 • ↓ • 孔内加5ul样品 • ↓ • 倒置放入37℃孵箱 • ↓ 3小时 • 在琼脂上覆盖一层2*营养琼脂（含1%琼脂糖、6%营养肉汤粉） • ↓ • 37℃过夜孵育 • ↓ • 测量抗菌环直径大小{抗菌活性单位=[抗菌环直径（mm）-3]*10}

2. 显微镜观察：将生防菌与靶标菌PDA平板对峙培养，出现抑菌圈后，挑取抑菌圈周围、靶标菌菌落中央的菌丝，镜检观察，菌丝变化情况，菌落颜色变化，菌核形成情况的变化。

螺旋毛壳ND35与苹果树腐烂病菌在PDA平板上的互作。螺旋毛壳ND35与苹果树腐烂病菌在PDA平板上的互作。（a）苹果树腐烂病菌(M)单独生长于培养基上。(b) 病菌生长于接种螺旋毛壳ND35的培养基上。病原生长推迟，在菌落边缘菌丝颜色发生改变。

图菌株粗提物对白菜软腐病 的抑制作用图用浇混平板测定菌株对白菜软腐病菌的拮抗作用

图用十字交叉法测定菌株对烟草赤星病菌的拮抗作用

图用十字交叉法测定菌株对烟草赤星、棉花枯萎、小麦赤霉病菌的拮抗作用

图不同浓度粗提物对 小麦根腐菌丝生长抑制作用图用十字交叉法测定菌株对水稻稻瘟的拮抗作用

图不同浓度的菌株粗提液对病原真菌菌丝生长的抑制作用图不同浓度的菌株粗提液对病原真菌菌丝生长的抑制作用（左为小麦赤霉，右为番茄早疫）

小麦根腐 放线菌图放线菌对小麦根腐的颉颃作用放线菌菌株的产孢丝

CK 处理 CK 处理图1 2152处理番茄早疫菌图22152 处理玉米大斑菌 CK 处理 CK 处理图3 2152处理苹果炭疽菌图4 2152处理小麦赤霉菌

发酵液菌丝团的形态 放线菌发酵液菌丝团的形态

A B 图放线菌发酵液对玉米小斑菌的抑制作用 A:对照（CK） B:菌丝顶端膨大成捻珠状

不同培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用。(a) 1%麦芽汁；(b) 3%玉米浸渍液

发酵液预处理方式选择 抑菌活性物质的粗提（有机溶剂萃取）抑菌活性物质的提纯（离子交换树脂法）高压液相色谱（HPLC）分离分析活性粗提物的部分理化性质研究优良拮抗菌株活性产物的提取工艺超滤、加热、透析金属离子处理、溶剂不同处理方式对发酵液抑菌活性的影响调pH值沉淀处理树脂类型洗脱液单组分优化酸碱、热稳定性贮存时间溶解度

真菌（菌丝生长抑制法） 细菌（滤纸片法）离体实验预防作用治疗作用活性实验活性粗提物的抑菌谱的测定活性粗提物的作用机理作用机理初探对菌丝生长的抑制作用对菌丝致病性的影响对分生孢子萌发的抑制作用对萌发分生孢子致病性的影响

培养液 CaCl2沉淀(发酵液：CaCl2=100mL：6g) 乙酸乙酯1:1（v/v）萃取三次有机相水相甲醇溶解，离心粗提物弃去溶于丙酮,离心沉淀上清 D301弱碱树脂柱（洗脱液由水、30%甲醇、 80% 弃去甲醇逐梯度转换，弃去紫外检测（200-400nm）活性最强部分 HPLC分离（流动相为的甲醇-水(78:22)，上样量20μl，流速1.5mL/s，紫外检测波长267nm）单组分（理化性质、结构鉴定、生物学实验）抗菌活性成分的分离分析路线

3. 活性粗提物的部分理化性质分析结果 • （1）酸碱、热稳定性： • 25 ℃-75 ℃温度下，活性很稳定；高温100℃条件下不稳定 • 弱酸条件有利于S-5210表现抑菌活性并对发酵液稳定性具有一定的保护作用 • 碱性条件下，发酵液活性较低，但变化平稳。 • （2）在酸性条件下贮存6个月，抑菌效果无明显变化，说明该活性物质较耐贮存。 • （3）抑菌活性物质易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂、氯仿和苯等多种有机溶剂，不溶于已烷、乙醚、石油醚等。 • （4）综合归纳可初步判断该活性物质是水溶性的碱性抗生素

图农用120对黄瓜霜霉病菌的拮抗作用 图粗提物对黄瓜霜霉病菌的抑制作用

图盆栽复筛试验（病原真菌为番茄叶霉，拮抗菌株为S-69和S-52左为远观，右为近观）图盆栽复筛试验（病原真菌为番茄叶霉，拮抗菌株为S-69和S-52左为远观，右为近观）

实验三 拮抗作用的皿内测定