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生物中心主要项目

生物中心主要项目. 吕成伟 南方医院生物治疗中心. 应用项目. CIK (Cytokine induced killer) TIL (Tumor infiltrating lymphocytes) DC/CTL (Dendritic cell / Cytotoxic T lymphcytes) 放免靶向治疗（ 131 I -McAb ） 肿瘤标志物. CIK. IL-2. 1976 年 Morgan 等发现小鼠脾细胞培养上清能刺激胸腺细胞生长的 T 细胞生长因子； 1979 年统一命名为 IL-2 。 1980 年发现 IL-2 能诱导自身 LAK 。

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Presentation Transcript

  1. 生物中心主要项目 吕成伟 南方医院生物治疗中心

  2. 应用项目 • CIK (Cytokine induced killer) • TIL (Tumor infiltrating lymphocytes) • DC/CTL (Dendritic cell / Cytotoxic T lymphcytes) • 放免靶向治疗（131I -McAb ） • 肿瘤标志物

  3. CIK IL-2 • 1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清能刺激胸腺细胞生长的T细胞生长因子；1979年统一命名为IL-2。 • 1980年发现IL-2 能诱导自身LAK。 • 1983年Taniguchi等从Jurkat白血病细胞成功克隆人IL-2的cDNA，基因工程IL-2问世，推动了基础和临床应用。 • 肿瘤、免疫缺陷、感染等

  4. CIK IL-2 • IL-2主要由T细胞或T细胞系产生： （1）CD4或CD8 T细胞： 丝裂原 CD4或CD8 同种异体Ag CD4 (PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺T细胞） （2）T细胞肿瘤细胞系或白血病细胞系 （3）T淋巴细胞杂交瘤

  5. CIK • IL-2生物学作用： （1）CD4及CD8细胞都是IL-2作用靶细胞 （2）促进杀伤细胞分化和效应功能： 诱导CTL、NK、LAK等分化和效应功能 诱导杀伤细胞产生IFN-γ、TNF-α等 增强CTL穿孔素基因表达 （3）直接或间接作用B细胞 （4）活化巨噬细胞： 促进Mφ 通过ADCC杀伤肿瘤

  6. CIK LAK细胞 • 1980年NIH癌症研究所Rosenberg等首先发现LAK细胞(lymphokine activated killer cell): 1. 纤维肉瘤C57BL/6小鼠脾细胞＋ IL-2 纤维肉瘤细胞（自身正常细胞－） 2. PBL + IL-2 自体或同种异体瘤细胞(MHC 非限制性） 3. LAK存在于大颗粒淋巴细胞（large granular lymphocytes,LGL)中，不同于T、B细胞和单核细胞

  7. CIK • 多种细胞因子均可增强LAK活性： GM-CSF、TNF、IL-1、3、5、6 IFN-γ显著增强LAK活性 Anti-CD3 McAb联合IL-2不仅能比单用IL-2更显著增加LAK数量也使单个和总体LAK细胞活性显著增加。（100～400倍/6~20倍）

  8. CIK • LAK体外长期培养:(临床) 3～5天 2～3周 数量100～1000倍 联合PHA或ConA 数量比单用IL-2高5～10倍。初始培养48小时内加入10ng/ml Anti-CD3扩增更明显，21天达1000倍。加入IFN-γ单个LAK细胞抗瘤活性提高几十倍。 LAK CIK (Cytokine induced killer)

  9. CIK • CIK的杀瘤机制 • 直接杀瘤： 识别结合相 效靶复合体 杀伤相 细胞毒颗粒；穿孔素；Ca++ 裂解相 间接杀瘤： IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-1α等的细胞毒/抑制作用；相互诱生、协同增强NK、Mφ杀伤肿瘤细胞。

  10. CIK 应用 • 只有联合应用IL-2/LAK细胞才具有显著的体内抗肿瘤作用。 • 1984年11月，FDA批准NCI进行临床试验。 • 1985年Rosenberg等首次报道联合IL-2/LAK细胞治疗25例各种常规疗法治疗无效的晚期肿瘤患者的临床疗效。 • IL-2/LAK细胞引起世人瞩目，并在基础和临床得到推广和改进。 • 肾细胞癌、黑色素瘤、结直肠癌、非何杰金氏淋巴瘤等疗效显著。

  11. CIK CIK制备流程

  12. TIL 简介 • 1986年发现经IL-2诱导的TIL体内抗瘤效果强于LAK 50～100倍；并可减少IL-2用量及副作用。 • 肿瘤间质，T淋巴细胞，CD8为主，非活化，拌用少量IL-2即可发挥明显抗瘤效果，副作用轻。 • 新TIL中T细胞对PHA呈低增殖反应，少分泌IL-2、IFN-γ等。 • Anti-CD3 McAb联合IL-2不仅能比单用IL-2更显著增加TIL数量也使单个和总体TIL细胞活性显著增加。可减少IL-2用量。

  13. TIL • TIL体外抗瘤作用 1. 经IL-2激活后TIL才具有显著杀伤活性（7～40天）。 2. TIL杀伤活性具有一定特异性。 3. IL-4、TNF、IFN-γ等可显著增强TIL杀伤作用。 4. 肿瘤抗原可增强TIL杀伤活性。（照射肿瘤细胞）

  14. TIL • TIL的体内抗肿瘤作用 1. TIL/IL-2输注具有显著的体内抗肿瘤转移效果。 2. TIL体内抗肿瘤转移作用有一定特异性。 3. IFN-α可增强TIL/IL-2体内抗肿瘤转移作用。 4. 环磷酰胺增强TIL体内抗肿瘤作用。

  15. CIK/TIL • CIK/TIL制备流程 无菌条件下抽取外周血/胸腹水（以肝素抗凝） 密度梯度离心 1500-2000rpm，15-20分钟 分离获取外周血单个核细胞（PBMNC) 600-800rpm，5分钟 纯化PBMNC(去除Ficoll、血小板及杂质） 计数，1×10e6个细胞/ml置培养瓶37℃， 5%CO2，100％湿度 诱导活化(IL-2,Human-serum,Anti-CD3,r-IFN,PHA) 第5－7天 高效扩增（IL-2,Human-serum,Anti-CD3) 第10-14天 收集CIK/TIL，全身/局部回输

  16. CIK/TIL *CIK/TIL临床应用 • CIK每疗程不低于100亿细胞；首次抽血前一周或抽血后即可输注IL-2；首次抽血后7～9天第一次回输CIK细胞。每周抽血一次，回输细胞两次；5～6周一疗程，全程拌IL-2治疗。 • TIL细胞经胸腔或腹腔穿刺收集胸腹水200ml以上，分离淋巴细胞培养，7～21天内分1～3次胸腹腔输注完毕。同时配合IL-2 20-50wu局部应用，2-3/周至积液完全吸收(或疗程结束)。

  17. DC/CTL DC细胞 • 1973年Steinman和Cohn等从小鼠脾组织分离 • 共同特征：树突状，膜MHC-Ⅱ、CD80、CD86，活化初始T细胞，激活CD8CTL、CD4Th细胞；非成熟DC摄取、加工、处理抗原，成熟DC递呈抗原能力是B、Mφ的100~1000倍，体内唯一专职抗原提呈细胞；MHC限制性。 • 来源：骨髓、外周血、脐带血。

  18. 肿瘤的发生与DC的功能缺陷 通过对肿瘤浸润性ＤＣ的研究发现：肿瘤细胞能自发分泌免疫抑制性细胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ-β、ＩＬ-10等作用于ＤＣ，使其表面分子的表达发生变化，无法提呈外来抗原或提呈抗原的能力低下，导致了肿瘤的免疫逃逸。

  19. DC治疗的理论依据 • 将机体的ＤＣ提取出来，经体外各种免疫调节剂的激活，再用各种形式抗原修饰ＤＣ(肿瘤抗原肽、细胞性抗原、ＤＮＡ或ＲＮＡ等)，然后回输体内，激活Ｔ细胞 ,产生强大的抗肿瘤免疫反应，从而解决因ＤＣ功能缺陷造成的肿瘤免疫逃逸。

  20. DC/CTL制备

  21. DC/CTL/IL-2的实施 (1) 微量法：抽血200ml/次，2周一次，共4次为一疗程，全程用IL-2 50-200wu 30-40次，或/和加IFN-γ 100wu 20-30次。 (2) 机分法：分离5000ml外周血收集单个核细胞。

  22. 放射免疫治疗的定义 以单克隆抗体为载体，以放射性核素为弹头，通过抗体特异性结合抗原表达阳性的肿瘤细胞，将产生β或α射线的放射性核素靶向到肿瘤细胞，并与肿瘤细胞特异性结合，实现对肿瘤的近距离内照射治疗。

  23. 单克隆抗体靶向治疗两种作用方式： • 直接作用：通过抗体依赖性细胞介导细胞毒（ADCC）、补体依赖细胞毒（CDC）的细胞溶解效应杀伤肿瘤细胞。 • 间接作用：单抗作为靶向载体，偶联细胞毒药物（放射性核素、化疗药物、毒素等）。靶向肿瘤后利用细胞毒杀伤肿瘤细胞。

  24. 放射免疫治疗是利用放射性核素的辐射对肿瘤细胞进行杀伤作用。它必须是发射能量较大的β射线、α粒子，最好是不发射γ射线对病房的防护较方便。符合上述条件的放射性核素不多。放射免疫治疗是利用放射性核素的辐射对肿瘤细胞进行杀伤作用。它必须是发射能量较大的β射线、α粒子，最好是不发射γ射线对病房的防护较方便。符合上述条件的放射性核素不多。

  25. 90Y、186Re、188Reβ辐射能量大是放射免疫治疗的首选放射性核素，但国内来源较困难，标记技术也较复杂。 131I为β能量较小，也存在γ辐射给辐射防护带来不便，但其供应十分方便，因此，是国内放手免疫治疗最常用的核素

  26. 2003年Press OW在Seminars in Oncology: 当前低度NHL治疗最有希望的治疗药物之一是能识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体，…..如今，最有希望的免疫连接物是放射性标记的抗体。

  27. IODO-GEN碘化标记 IODO-GEN是固相氧化剂，其碘化标记法于1978年由Fraker首先报道放射性碘溶液和蛋白质同时放入已用IODO-GEN包被的容器中，－I被氧化并立即取代蛋白质上酪氨酸残基中的H而成为放射性碘化标记蛋白。经过数分钟后将标记物从容器中吸出即终止反应。经凝胶柱过滤后即可得到碘化标记物纯品。

  28. 放射免疫治疗淋巴瘤的优势 • 恶性淋巴瘤具有良好的放射敏感性 • 治疗效果不受机体免疫功能影响 • β射线 穿透力强，可到达肿瘤深部 • 疗效可靠，毒副作用少

  29. 病例选择条件 • 所有患者均有预后不良因素：如晚期、高危、初治未达缓解、复发及全身多处淋巴结肿大； • 无重要脏器功能不全； • Karnofsky评分≥60分； • 年龄≤70岁； • 外周血常规白细胞（WBC）≥3.0×109/L，血小板（PLT）≥80×109/L，血红蛋白（HGB）≥90g/L； • 病理免疫组化提示CD20(++~+++)。

  30. 治疗模式 治疗模式 CD20单抗 131I 非清髓剂量 100-200mg 50-100mci 清髓剂量 200-400mg 150-300mci

  31. 131I-抗CD20抗体应用方案 • 标记方法：固相氧化剂标记法（IODOGEN）。 • 甲状腺保护：用药前一周至用药后一周连续口服1%碘化钾溶液10~20ml/次，每日三次。 • 标记率及用法：每次剂量抗CD20抗体 100mg标131I 50~100 mCi，1/3局部病灶直接注射，2/3静脉全身使用。每2~3个月一次，2~3次为一疗程。 • 预防过敏反应：用药前30~60分钟苯海拉明40mg肌注。

  32. 131I-抗CD20抗体的毒副反应和处理 • 畏寒发热 普威、非那根 • 局部红肿 不处理或普威、消炎痛 • 重度骨髓抑制 (WBC≤1.0×109/L，PLT≤25×109/L，HGB≤65g/L) 住无菌层流病房，皮下注射G-CSF，补充血小板、红细胞，预防感染，防止出血

  33. 放射免疫治疗其它肿瘤 • 食管癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌肝癌、前列腺癌、乳腺癌等

  34. 感谢！

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