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人的外周血淋巴细胞培养

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人的外周血淋巴细胞培养. 一、实验目的:. 二、实验原理:. 三、实验材料:. 四、操作步骤:. 五、结果分析:. 六、参考文献:. 一、实验目的:. 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。. 二、实验原理:. 外周血液中的小淋巴细胞,几乎都处在 G1 期 ( 或 Go 期 ) ,一般情况下是不再分裂的,在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时,这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞,随后进入有丝分裂。这样经过短期培养,秋水仙素的处理,低渗和固定,就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学,药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。. 三、实验材料:.

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一、实验目的:

二、实验原理:

三、实验材料:

四、操作步骤:

五、结果分析:

六、参考文献:

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一、实验目的:

掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。

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二、实验原理:

外周血液中的小淋巴细胞,几乎都处在G1期(或Go期),一般情况下是不再分裂的,在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时,这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞,随后进入有丝分裂。这样经过短期培养,秋水仙素的处理,低渗和固定,就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学,药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

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三、实验材料:

人的外周血。

用具:

2毫升灭菌注射器,离心管,吸管,试管架,量筒,

培养瓶,试剂瓶,酒精灯,烧杯,载玻片,切片盒,

天平,离心机,恒温培养箱,显微镜。

器皿的清洗和消毒

玻璃器皿在使用前,均应用肥皂水洗刷,清水冲净,烘干后浸泡在洗液中至少2h,再用流水冲洗,烘干待消毒。

将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装,放入干燥消毒箱内;150℃1h。

隔离衣、口罩。橡皮塞,注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。

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三、实验材料:

药品

(1) RPMI“1640”培养基:称取“1640”粉末10.5克,用1000ml的双蒸水溶解,如溶液出现混浊或难以溶解时,可用干冰或CO2气体处理,如pH值降至6.0时,则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO,1.0-1.2g,以干冰或CO2气体校正pH至7.0-7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌,分装待用。

(2) 肝素:作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U),用40ml的生理盐水溶解,此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。

(3) 秋水仙素:作为有丝分裂的阻止剂,它能改变细胞质的粘度;抑制细胞分裂时纺锤体形成,使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg,用100ml生理盐水溶解,用6号细菌漏斗过滤,然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0.05-0.1ml加入5ml的培养物中,其最终浓度为0.4—0.8ug/ml。

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三、实验材料:

(4) 植物凝血素(PHA):是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单,直接用四季豆的浸出液;另一种较复杂,最后制品为粉末。如用之得当,二种方法均可获得良好的效果。

盐水浸取法:最好用皮色四季豆,但其它颜色如红斑色、黑色.黄色,白色的四季豆亦可。取豆子20g,用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃),次日倒去水分,将豆子放入组织搅碎器内,加30ml生理盐水,开动搅碎器使之成为粘糊状,向搅碎器再加70ml生理盐水,混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转/min离心15min,取上清液,用生理盐水稀释10倍,5号除菌滤斗过滤,分装小瓶,冰冻保存。

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三、实验材料:

酒精乙醚提取法:四季豆50g,先用生理盐水洗净。将豆浸入60ml盐水中,保存于4℃冰箱内,24h后用组织搅碎器将其磨成匀浆,再加140ml盐水,置4℃冰箱中24h,取出后以6000转/min离心20min,吸取上清液,调pH至5.6(用0.1mol/L HCl调)之后,每100ml上清液加40ml无水酒精,加以搅拌,以3000转/min离心15min,取上清液,弃去沉淀。在每100ml上清液中加170ml10%乙醚无水酒精(10ml乙醚十90ml无水酒精)以3000转/min离心15min,取沉淀放入培养皿中,在含有硅胶的抽气干燥器中抽气2—4d,沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末,以0.85%NaCl液配成1%的溶液,此PHA溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中,冰冻保存。使用时每5ml培养物加0.1ml即可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作,那么配成的PHA溶液便无需用细菌滤器过滤。

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三、实验材料:

(5)抗菌素

青霉素(以每瓶40万U为例): 以4ML生理盐水(或培养基)稀释,则每ML含10万U。取1ml加入100ml培养基中,则最终浓度为100U/ml。

链霉素(以每瓶50万U为例):以2ml生理盐水(或培养基)稀释,则每ml含25万U。取0.4ml(含10U)加入1000ml培养基中,则每ml含100U(即100μg)。(100万U=lg,lg=1×106μg)。

(6)姬姆萨染液:0.5g姬姆萨粉末,加33ml纯甘油,在研钵中研细,放在56℃恒温水浴锅中保温90min,再加入33ml甲醇,充分搅拌,用滤纸过滤,收集在棕色细口瓶中保存,作为原液。用时以磷酸缓冲液(pH7.4)1:10稀释。

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三、实验材料:

(7)0.1mol/L磷酸缓冲液: pH7.4—7.6

A. Na2HPO4·12H20 28.8g

KH2PO4(无水) 2.67g

溶解于1000ml双蒸水中。

B. Na2HPO4·7H20 2.164g

NaH2PO4·2H20 0.3g

溶解于1000ml双蒸水中。

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四、操作步骤:

1.培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各试剂分装入培养瓶,每瓶量为:

培养液(RPMIl640或M199) 4ml

小牛血清 lml

PHA 0.2ml

肝素 0.05ml

双抗(青霉素加链霉素)培养液中最终浓度各为: 100U/ml

用3.5%NaHCO3调pH到7.2—7.4,分装到20ml的玻瓶中,用橡皮塞塞紧,待用或置于0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出,放入37℃恒温锅中温育10min。

2.采血:用2ml灭菌注射器吸取肝素(500U/ml)0.05ml湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤,自肘静脉采血约0.3ml,在酒精灯火焰旁,自橡皮塞向培养瓶内(内含有生长培养基5ml)接种,轻轻摇动几次,直立置37℃±0.5℃恒温箱内培养。

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四、操作步骤:

3.培养:置37℃温箱内培养66—72h。

4.秋水仙素处理:培养终止前在培养物中加入浓度为40μg/ml的秋水仙素0.05—0.lml,最终浓度为0.4—0.8μg/ml,置温箱中处理2—4h。

5.低渗处理:低渗液的种类较多,如0.075mol/L的KCl溶液,0.95%的枸橼酸钠溶液,用蒸馏水稀释4倍的Hanks液,也可直接用蒸馏水。秋水仙素处理完毕,小心地从温箱取出培养瓶,用滴管吸弃上清液,培养物沉积在瓶底,然后加入温育的低渗液5毫升,用滴管轻轻冲打成细胞悬液,装入离心管中置37℃温箱内处理20min,使红细胞破碎,白细胞膨胀。

6.离心:以每1000rpm/min,离心5min,弃去上清液,收集白细胞。

7.固定:固定液为甲醇:冰醋酸:3:1。每只离心管中,加入固定液2-4ml,片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液,在室温中固定15min后,离心,吸弃上清液,留下白细胞。

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四、操作步骤:

8.再固定:加入固定液2ml,用吸管轻轻打散,室温下继续固定15min(过夜也可以)。

9.再离心:除去上清液,留下白细胞制片。

10.制片:向上述离心管中滴入固定液0.5毫升,用滴管小心冲打成悬液,从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片,每片滴加悬液1—3滴,用嘴轻轻吹散,用电吹风吹干,或在酒精灯火焰上微微烤干。

11.染色:用磷酸缓冲液(pH7.4)稀释后的姬姆萨染色液染色20min,然后倒去染液,用蒸馏水轻轻冲洗。

12.镜检:待稍午后,在显维镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后用高倍油镜观察。

13. 封片:用加拿大树胶封片。选择染色体清晰,分散度好 的细胞进行显微摄影,进行核型分析(见图20—1)。

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四、操作步骤:

20-1

人体外周血培养与染色体标本制作示意图

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五、结果分析:

实验注意事项

1.接种的血样愈新鲜愈好,最好是在采血后24h内进行培养,如果不能立刻培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,会影响细胞的活力。

2.在培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37+0.5℃。培养液的最适pH7.2—7.4。

3.培养过程中,如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻振荡厂使凝块散开,继续放回37℃恒温箱内培养。

4.制片过程中,如发现细胞膨胀得不大,细胞膜没有破裂,染色体聚集一团伸展不开;可将固定时间延长数小时或过夜。

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五、结果分析:

核型分析:人类每个体细胞有46条染色体,22对常染色体和一对性染色体,男子是46,XY女子是46,XX(见图20—2)。

求取以下三个参数:

可以将人的46条染色体分成A、B、C、D、E、F、G七组,作为进一步识别和鉴定染色体的依据。

图20-2 人淋巴细胞染色体(46, XY)

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六、参考文献:

项维,吕曼硎,7(1963),《科学通报》,科学出版社,北京。