תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומבינטיבי

1. תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומבינטיבי עליך לשבט את רצף ה-m-RNA הבשל-(דנ"א קומפלמנטרי cDNA), המופיע באיור 1, מקודון תחילת התירגום (ATG) ועד אקסון 18 (כולל). הרצף המופיע בתמונה הוא של גדיל הסנס של ה- .cDNA יש לציין כי בתוך רצף זה קיימים באופן טיבעי הרצפים של אנזימי הרסטריקציה HindIII ו- BamHI עליך להתחשב בעובדה שבמעבדה קיים האנזים RNA polymerase SP6 בלבד שישמש אותך בהמשך המחקר בסנטזת ה-רנ"א של cDNA המשובט. 1) עליך להטיל את הרצף המופיע באיור 1 על הגנום האנושי. יש להיכנס לאתר http://genome.ucsc.edu ולהקיש על אופציית ה- .Blat • א) מה שם הגן ? האם ACAD9 או MCAD? • ב) מהו רצף גבול האקסון -אינטרון בקצה ה-3’ של אקסון מספר 2 (אותיות גדולות מייצגות רצף אקסוני, אותיות קטנות מייצגות אינטרון, גבול האקסון אינטרון מוצג בקו אלכסוני): • AGG/gtatg • tag/AAAGAA • ATG/gtaagt • AAG/gtaacg 2) מה הן הפעולות שתבצע על-מנת לשבט את רצף ה-cDNA: פרט כל שלב ושלב (מהגברת מקטע הגן עצמו ועד שלב הפקת הפלסמיד): • א) רשום את רצפי שני הפריימרים המיועדים להגברת רצף ה-cDNA, הוסף לכל פריימר את אנזים הרסטריקציה המתאים לשיבוט, מה יהיה הרצף של אנזים הרסטריקציה לאחר החיתוך? • ב) איך יראו קצוות הפלסמיד לאחר החיתוך בשני אנזימי הרסטריקציה – נא להציג באיור. • ג) לאחר חיתוך תוצר ה-PCR שקיבלת, עליך להמשיך בשיבוטו. איך מתבצע תהליך השיבוט – פרט את כל השלבים (עד לשלב קבלת המושבות) והחומרים בהם תשתמש • ד) רשום איך מתבצעת ראקציית ה-PCR: באיזה חומרים משתמשים ואיך עובד מכשיר ה-PCR? 3) כל הכבוד, קיבלת ארבע מושבות בצלחת- מה תעשה על-מנת לאשש את הצלחת השיבוט? פרט לפחות שלוש אפשרויות. החומרים והמכשירים העומדים לרשותך במעבדה הינם (לא כל החומרים כתובים): • רצף ה-cDNA ראה תמונה 1 • פלסמיד אשר לתוכו תשבט את הרצף הנדרש. השיבוט נעשה לאתר ה-MCS- (multiple cloning site)- ראה תמונה 2 • שלושה אינזימי חיתוך (רסטריקציה) ואתרי החיתוך שלהם מופיעים בתמונה מספר 3. • במעבדה ישנו מכשיר PCR, קיט תעשייתי להפקת פלסמיד וכמו כן ניתן להזמין פריימרים (רצפי התחל).

2. תמונה 1: cDNA ATGAGCGGCTGCGGGCTCTTCCTGCGCACCACGGCTGCGGCTCGTGCCTGCCGGGGTCTGGTGGTCTCTACCGCGAACCGGCGGCTACTGCGCACCAGCCCGCCTGTACGAGCTTTCGCCAAAGAGCTTTTCCTAGGCAAAATCAAGAAGAAAGAAGTTTTCCCATTTCCAGAAGTTAGCCAAGATGAACTTAATGAAATCAATCAGTTCTTGGGACCCGTGGAAAAATTCTTCACTGAAGAGGTGGACTCCCGAAAAATTGACCAGGAAGGGAAAATCCCAGATGAAACTTTGGAGAAATTGAAGAGCCTAGGGCTTTTTGGGCTGCAAGTCCCAGAAGAATATGGTGGCCTGGGCTTCTCCAACACCATGTACTCAAGACTAGGGGAGATCATCAGCATGGATGGGTCCATCACTGTGACCCTGGCAGCGCACCAGGCTATTGGCCTCAAGGGGATCATCTTGGCTGGCACTGAGGAGCAGAAAGCCAAATACTTGCCTAAACTGGCGTCCGGGGAGCACATTGCAGCCTTCTGCCTCACGGAGCCAGCCAGTGGGAGCGATGCAGCCTCAATCCGGAGCAGAGCCACACTAAGTGAAGACAAGAAGCACTACATCCTCAATGGCTCCAAGGTCTGGATTACTAATGGAGGACTGGCCAATATTTTTACTGTGTTTGCAAAGACTGAGGTCGTTGATTCTGATGGATCAGTGAAAGACAAAATCACAGCATTCATAGTAGAAAGAGACTTTGGTGGAGTCACTAATGGGAAACCCGAAGATAAATTAGGCATTCGGGGCTCCAACACTTGTGAAGTCCATTTTGAAAACACCAAGATACCTGTGGAAAACATCCTTGGAGAGGTCGGAGATGGGTTTAAGGTGGCCATGAACATCCTCAACAGCGGCCGGTTCAGCATGGGCAGCGTCGTGGCTGGGCTGCTCAAGAGATTGATTGAAATGACTGCTGAGTACGCCTGCACAAGGAAACAGTTTAACAAGAGGCTCAGTGAATTTGGATTGATTCAGGAGAAATTTGCACTGATGGCTCAGAAGGCTTACGTCATGGAGAGTATGACCTACCTCACAGCAGGGATGCTGGACCAACCTGGCTTTCCCGACTGCTCCATCGAGGCAGCCATGGTGAAGGTGTTCAGCTCCGAGGCCGCCTGGCAGTGTGTGAGTGAGGTGCTGCAGATCCTCGGGGGCTTGGGCTACACAAGGGACTATCCGTACGAGCGCATATTGCGTGACACCCGCATCCTCCTCATCTTCGAGGGAACCAATGAGATTCTCCGGATGTACATCGCCCTGACGGGTCTGCAGCATGCCGGCCGCATCCTGACTACCAGGATCCATGAGCTTAAACAGGCCAAAGTGAGCACAGTCATGGATACCGTTGGCCGGAGGCTTCGGGACTCGCTGGGCCGAACTGTGGACCTGGGGCTGACAGGCAACCATGGAGTTGTGCACCCCAGTCTTGCGGACAGTGCCAACAAGTTTGAGGAGAACACCTACTGCTTCGGCCGGACCGTGGAGACACTGCTGCTCCGCTTTGGCAAGACCATCATGGAGGAGCAGCTGGTACTGAAGCGGGTGGCCAACATCCTCATCAACCTGTATGGCATGACGGCCGTGCTGTCGCGGGCCAGCCGCTCCATCCGCATTGGGCTCCGCAACCACGACCACGAGGTTCTCTTGGCCAACACCTTCTGCGTGGAAGCTTACTTGCAGAATCTCTTCAGCCTCTCTCAGCTGGACAAGTATGCTCCAGAAAACCTAGATGAGCAGATTAAGAAAGTGTCCCAGCAGATCCTTGAGAAGCGAGCCTATATCTGTGCCCACCCTCTGGACAGGACATGCTGA

3. MCS תמונה 2: פלסמיד השיבוט

4. 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ G AATTC 3’ 3’ CTTAA G 5’ EcoRI 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ 5’ G GATCC 3’ 3’ CCTAG G 5’ BamHI האנזימים הקיימים במעבדה: 5’ TCTAGA 3’ 3’ AGATCT 5’ 5’ T CTAGA 3’ 3’ AGATC T 5’ XbaI