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植物学专题讨论之二. 离体培养液蔗糖浓度对水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影响. 导 师： 粱建生 教授 报告人： 王 玉 霞 2005 年 12 月 20 日. 前言. 蔗糖合成酶的作用： 蔗糖 +UDP 果糖＋ UDPG. 一、试验设置. 1. 材料与方法 1.1 供试材料 供试品种为具较高结实率的超级稻两优培九。 2004 年种植于扬州大学农学院试验田，单本植，田间管理一致，同一般大田栽培。始穗期选择生育进程和长势长相基本一致的主茎进行标记 , 待稻穗穗颈节露出剑叶鞘 1 ～ 2 ｄ , 取样进行穗培养.
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植物学专题讨论之二 离体培养液蔗糖浓度对水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影响 导 师： 粱建生 教授 报告人： 王 玉 霞 2005 年12月20日
前言 蔗糖合成酶的作用： 蔗糖+UDP 果糖＋UDPG
一、试验设置 1.材料与方法 1.1供试材料 供试品种为具较高结实率的超级稻两优培九。2004年种植于扬州大学农学院试验田，单本植，田间管理一致，同一般大田栽培。始穗期选择生育进程和长势长相基本一致的主茎进行标记,待稻穗穗颈节露出剑叶鞘1～2ｄ,取样进行穗培养
在无菌室中,先用体积分数为1%次氯酸钠溶液对单茎穗穗颈节以下部分进行表面消毒,在无菌水中剪去距穗颈节11～12ｃｍ以下部分,然后在超净工作台将单茎穗转移到盛有50ｍＬ培养液的玻璃管中,用无菌医用棉封口。每处理重复6次。无菌室用紫外线消毒,进入无菌室的器具、玻璃管、医用棉等都经高温高压或φ=70%酒精消毒。基本培养基成分包括MS无机盐和VB5有机成分，蔗糖浓度依试验处理定。培养玻璃管用铝箔包裹，在暗中培养，穗培室温度24～25℃。在无菌室中,先用体积分数为1%次氯酸钠溶液对单茎穗穗颈节以下部分进行表面消毒,在无菌水中剪去距穗颈节11～12ｃｍ以下部分,然后在超净工作台将单茎穗转移到盛有50ｍＬ培养液的玻璃管中,用无菌医用棉封口。每处理重复6次。无菌室用紫外线消毒,进入无菌室的器具、玻璃管、医用棉等都经高温高压或φ=70%酒精消毒。基本培养基成分包括MS无机盐和VB5有机成分，蔗糖浓度依试验处理定。培养玻璃管用铝箔包裹，在暗中培养，穗培室温度24～25℃。 1.2水稻穗离体培养
1.3试验处理 （1）不同浓度的蔗糖溶液处理 0、50、100、150、200mM （2）不同时间的蔗糖溶液处理 12、24、48h （3）不同渗透性溶液处理 Mit、Sit、KCl100mM （4）相同浓度的己糖溶液处理 Glu、Fru、Glu+Fru 100mM （5）己糖激酶抑制剂处理 NAG （6）糖类似物溶液处理 Man、3-O-MG
2.试验方法 2.1 蔗糖、可溶性总糖的测定 2.2 蔗糖合成酶活性的测定
10ml80%乙醇 80C水浴30min 2000rpm 离心15min 0.1克干样 冷却 残渣 10ml80%乙醇 80C水浴30min 2000rpm 离心15min 冷却 残渣 10ml80%乙醇 80C水浴30min 2000rpm 离心15min 冷却 残渣 合并三次上清液
定容至100ml 蔗糖测定 可溶性总 糖测定 吸0.9ml提取液 吸1.0ml提取液 0.1ml2N NaOH 1.0ml水 沸水浴10min 4ml0.2%蒽酮 冷却 15min沸水浴 1ml0.1%间苯二 酚 3ml10N HCl 80C水浴60min 冷却 冷却 比色OD500 比色OD620
酶的提取均在0-4℃低温下进行。取20粒-86℃冰箱贮存的籽粒，剥壳去胚后，籽粒加1.5ml提取介质快速研磨12,000rpm 离心15min，取上清夜作为粗酶液。 酶的提取介质为：100mmol/LHepes/KOH (pH7.5), 5 mmol/LMgCl2, 5mmol/LDTT,20mmol/L巯基乙醇,10mmol/L抗坏血酸，2 mmol/LEDTA，1%(w/v)PVP。
酶的反应介质为：0.2ml 的反应介质中含有50mmol/L Hepes/KOH (pH7.5),5mmol/L Mgcl2 ,3mmol/L UDPG,15mmol/L 果糖，一定量的酶液。酶的活性测定过程参照Roe（1934） 的方法，混合物30℃反应30分钟2mol/L NaOH溶液终止反应，用间苯二酚测定生成的蔗糖的量。酶活力单位为µmol蔗糖/mg蛋白·分钟。 蛋白质含量测定：蛋白质的测定用Bradford(1976)方法，以BSA为标准蛋白。
二、结果与分析 1.不同浓度的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响 由图可见，在介质蔗糖浓度为100mM范围内，蔗糖合成酶活性随蔗糖 浓度的提高而提高，当蔗糖浓度为150mM时略有下降，之后又再升高。 Fig.1.Carbohydrate contents and SuSy activity in the grains of rice . Excised rice panicles were fed with solution containing the indicated concentrations of sucrose(0-200mM).
2.不同时间的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响2.不同时间的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响 由图可见，蔗糖加入后促进了蔗糖合成酶活性的提高。这种效应在12小时时很明显，24小时达到峰值，之后开始下降。 Fig.2. Carbohydrate contents and SuSy activity in the rice grains from excised rice panicles treated in H2O or in 100mM sucrose for 12,24,48h.
3.不同渗透性糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响3.不同渗透性糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响 Table 1. Effect of various osmotically activy sugars on SuSy activity in rice grain from excised rice paniclesthat were cultured for 24h in water,sucrose, Kcl, mannitol,or soribitol. 由表1看出，用Kcl、甘露醇、山梨醇作为糖介质培养离体穗24小时，在百粒重、蔗糖含量、总糖含量及蔗糖合成酶活性与对照差异不大，这说明蔗糖对籽粒发育以及蔗糖合成酶活性的调节不是因为渗透压的影响。
4.己糖和抑制剂处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响4.己糖和抑制剂处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响 Table 2. Effect of hexoses and NAG on SuSy activity. NAG: N-acetyl-glucosamine, an inhibitor of hexokinase(HXK); SuSy: Sucrose synthase In experiment A, excised rice panicles were fed water,100mMsucrose,100mM glucose,100mMfructose, or 100mMglucose plus 100mMfructose for 24h. In experiment B, excised rice panicles were fedwater or 100mMsucrose ,glucose, fructose in the presence or absence of 10mMNAG for 24h. 由表2可见，等摩尔浓度的己糖处理后蔗糖合成酶活性虽有提高，但这种效应要低于蔗糖对它的影响。模拟蔗糖水解的处理也没有达到蔗糖的促进效应。加入NAG阻断己糖调节途径，对蔗糖的调节效应没有大的影响。这说明蔗糖调节是不依赖己糖激酶的途径。
5.己糖类似物处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响5.己糖类似物处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响 Table 3. Sugar regulation of SuSy activity in the rice grains. Excised rice panicles were fed with water,20mMsucrose,20mMglucose,20mMmannose and 20mM3-O-methylglucose(3-O-MG) in the dark for 24h. 由表3可知，糖的类似物甘露糖，3－氧甲基葡萄糖培养离体穗24小时，在百粒重、蔗糖含量、总糖含量及蔗糖合成酶活性与对照差异不大。
6.蔗糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的可逆调节6.蔗糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的可逆调节 由图3可见，蔗糖处理过的离体穗再放于水中24小时后可以解除蔗糖效应，同样水中培养的离体穗在蔗糖溶液中再处理24小时后能产生一样的蔗糖促进效应。这说明蔗糖对蔗糖合成酶活性的调节作用是可逆的。 Fig.3. Sucrose-mediated changes in SuSy activity were reversible. Four excised rice panicles, and two of them were placed in water and the other two in 100mMsucrose.SuSy activity were measured from one panicles of each treatment after 24h.At the same time, the other two panicles were placed in the opposite treatment solution for another 24h.
三、讨论 1.对蔗糖合成酶活性的调节主要是蔗糖的效应，且与外源蔗糖的浓度以及内源蔗糖含量都是相关的， 2.蔗糖对蔗糖合成酶活性的调节是可逆的。 3.蔗糖合成酶活性在一定浓度范围内与蔗糖浓度成正效应。 4.外源蔗糖的加入会改变溶液的水势影响蔗糖的运输，为了消除渗透压的影响用相同摩尔浓度的渗透性糖处理证明蔗糖调节不是渗透压的影响。
由于植物中的蔗糖易水解成葡萄糖和果糖，所以对蔗糖特异的信号传导途径的解释较困难。然而，最近的实验表明，因植物存在蔗糖特异的信号传导途径从而影响基因的转录和翻译。例如，蔗糖特异地诱导patatin启动子基因转录首次证明蔗糖能特异地对蔗糖同向转运体的转录和翻译进行调节，而己糖等其他糖则不具备此调节作用。本实验也证明蔗糖合成酶活性是受蔗糖调节的。由于植物中的蔗糖易水解成葡萄糖和果糖，所以对蔗糖特异的信号传导途径的解释较困难。然而，最近的实验表明，因植物存在蔗糖特异的信号传导途径从而影响基因的转录和翻译。例如，蔗糖特异地诱导patatin启动子基因转录首次证明蔗糖能特异地对蔗糖同向转运体的转录和翻译进行调节，而己糖等其他糖则不具备此调节作用。本实验也证明蔗糖合成酶活性是受蔗糖调节的。
结束语 关于植物糖感知和信号传导机制的研究取得很大进展，已经从拟南芥中分离出了许多糖响应突变体，糖调控网络及其与多重信号传导途径相互作用的关系图已见雏形，但对不同糖水平下信号传导网络进行详细解释还面临许多困难; 多细胞的光合有机体固有的复杂性；植物在不同发育时期对内源和外源信号表现不同的敏感性，因此幼叶和老叶叶肉细胞可能对糖有不同的反应；高等植物的遗传分析要比单细胞的酵母复杂得多。然而，模式植物拟南芥基因组全序列的测定、突变体的获得和微阵列技术的发展都为植物糖信号传导的遗传分析提供了可行性。
