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第五章 原核生物中的基因工程

第五章 原核生物中的基因工程. 利用原核生物细胞进行基因工程操作的优越性： 1. 原核生物结构相对简单，代谢途径和基因表达调控过程相对清楚； 2. 易于操作和大规模地培养； 3. 将一种原核生物的基因克隆后转移到另一种原核细胞中表达，可获得有活性的基因产物，并形成特定代谢物合成途径。由于原核生物种类繁多，真核细胞所有的基因产物几乎在原核生物中都能找到，因此原核表达系统生产基因工程产物非常有前途。 4. 目前应用最多的是大肠杆菌，其基因组测序完成，其中有相当多的基因已经被鉴定 , 是目前应用最多的原核生物表达系统。. 原核生物表达系统的应用.

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第五章 原核生物中的基因工程

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Presentation Transcript

  1. 第五章 原核生物中的基因工程

  2. 利用原核生物细胞进行基因工程操作的优越性：利用原核生物细胞进行基因工程操作的优越性： 1.原核生物结构相对简单，代谢途径和基因表达调控过程相对清楚； 2.易于操作和大规模地培养； 3.将一种原核生物的基因克隆后转移到另一种原核细胞中表达，可获得有活性的基因产物，并形成特定代谢物合成途径。由于原核生物种类繁多，真核细胞所有的基因产物几乎在原核生物中都能找到，因此原核表达系统生产基因工程产物非常有前途。 4.目前应用最多的是大肠杆菌，其基因组测序完成，其中有相当多的基因已经被鉴定,是目前应用最多的原核生物表达系统。

  3. 原核生物表达系统的应用 目前的基因工程产品有相当多是原核生物表达体系获得的。如基因工程胰岛素；干扰素;基因工程疫苗；诊断试剂，包括分子生物学中的工具酶，如限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA连接酶；逆转录酶等等。 有些真核生物基因在原核细胞中的表达并不能成功，主要原因有： 1.不能形成其天然构象； 2.没有真核细胞的蛋白合成和加工系统； 3.内源性蛋白酶会降解一些构象不正确的异源蛋白； 4.内毒素会影响蛋白产物在人体中的应用。

  4. 一、影响外源基因在大肠杆菌中 高效表达的因素 外源基因在大肠杆菌中高效表达的主要控制因素包括：提高表达产物的表达量；抑制蛋白酶对表达产物的降解作用和恢复蛋白质的特异空间结构。 决定蛋白表达水平的因素主要有：启动子的效率；SD序列；密码子的频率；终止子的效率；质粒的拷贝数。

  5. （一）启动子 1.启动子的筛选 gal K基因上游无启动子，将大肠杆菌基因组DNA随机打断，插入gal K 基因的上游，筛选表达gal K最强的克隆可获得其最佳的启动子。

  6. 2.常见的启动子： -35区 -10区 保守序列 TTGACA TATAAT PL TTGACA GATACT recA TTGATA TATAAT tr p TTGACA TTAACT lac TTTACA TATAAT tac TTGACA TATAAT traA TAGACA TAATGT

  7. 3.启动子的最佳距离 在大肠杆菌细胞中，多数启动子与转录起点之间的距离约为6-9个碱基，但对外源基因的表达这并不是最佳的。最佳的启动子距离用克隆方法解决。

  8. 启动子最佳距离的筛选质粒构建

  9. 4.启动子的可控性 重组基因表达后，会对宿主细胞的生长有抑制作用。所以一般是将工程菌的生长和蛋白的表达分离。先让菌体数量增长，然后再诱导物（IPTG,异丙基--D硫代半乳糖苷） 重组基因的表达，并且诱导的时间不能太长，否则表达水平也不高。

  10. 现在最常见的是大肠杆菌的Lac Z 启动子：

  11. PL启动子采用双质粒表达系统

  12. How dos T7 promoter work？

  13. （二）、SD序列 原核生物的mRNA的5‘端都有一段SD序列，这一段序列与核糖体小亚基上的16sRNA的3’端序列互补，作为翻译识别序列。

  14. （三）、终止子： 外源基因在强启动子的作用下会转录过头，产生长短不一的mRNA。这回带来以下影响： （1）过长转录消耗较多的时间和能量； （2）过长转录影响下游某些功能区，如复制起点，选择标记等的功能，甚至导致重组质粒不稳定； （3）产生不必要的蛋白，消耗能量； （4）过长转录导致不正确的二级结构，降低翻译效率。 因此，在外源基因的下游，通常要接上终止子。

  15. 终止子的筛选： 将DNA序列插入启动子与四环素抗性基因之间，在四环素培养基中不能生长，在Amp培养基中能生长的克隆为候选克隆。

  16. （四）.密码子使用频率 不同生物以致同种生物不同蛋白使用兼并密码的频率是不一样的，其原因： （1）不同生物细胞中碱基的组成； （2）密码子与反密码子相互作用的自由能差异； （3）细胞内tRNA的含量。

  17. （五）质粒拷贝数 在细胞中，核糖体的数量远远大于mRNA的数量，所以，mRNA分子的数量对蛋白产量起到重要的作用。选择高拷贝的质粒可以提高mRNA的表达水平。

  18. 由于细胞中质粒拷贝数增加会影响细胞的生活力，所以不希望质粒数在任何时候都高，希望构建一种拷贝数可控的质粒。由于细胞中质粒拷贝数增加会影响细胞的生活力，所以不希望质粒数在任何时候都高，希望构建一种拷贝数可控的质粒。 pCP3质粒是将含强启动子PL的质粒pPlc2833，将pKN402上的温度敏感型复制序列转移到该质粒上即构建成pCP3质粒。 重组后的质粒的拷贝数对温度的敏感性加强。

  19. 温度敏感控制型质粒

  20. 二、大肠杆菌中蛋白表达方式

  21. （一）包涵体异源蛋白表达 在某些生长条件下，大肠杆菌细胞内积累特殊的生物大分子，形成一种有包膜或没包膜的颗粒结构，这种结构叫做包涵体（Inclusion body).基因工程菌大量合成的非天然的同源或异源蛋白常常形成包涵体存在于细胞内。

  22. 1.包涵体的性质 包涵体的组成有3部分： 大量表达的外源蛋白（50%）； 细胞内高表达蛋白，如RNA聚合酶，核糖核蛋白体和外膜蛋白； DNA/RNA和脂多糖。 包涵体在相差显微镜和电子显微镜下可见，因此又叫光折射体。

  23. 从包涵体中纯化蛋白的好处是： 1.利用其较高的密度，用高速离心机离心获得包涵体颗粒，实际上起到了初步纯化的作用； 2.形成包涵体后，不易被细胞内的蛋白酶降解。 不利因素： 1.洗脱时有一些损失； 2.包涵体一般没有活性，需要变性后再复性时需要高浓度的变性剂，在复性之前，需要通过透析方式出去这些高浓度的变性剂，使操作难度增大。

  24. 2.包涵体形成机制 （1）折叠状态的蛋白质聚集作用，由于高速表达蛋白质形成的结构是随机折叠的，二硫键多数是错配的，其构象是不正确的，错误构象的蛋白溶解度极低，易于生成包涵体。 （2）非折叠状态的蛋白质聚集作用，高速表达的蛋白质，加之热稳性差，导致蛋白处于非折叠状态。 （3）折叠中间体的聚集作用。

  25. 影响蛋白质包涵体形成的机制包括： （1）.温度。一般地，较低的温度有利于蛋白的折叠（但也不尽然），较高的温度不利于折叠，而有利形成包涵体； （2）.表达水平，过量表达有利于形成包涵体，但降低表达水平并不能提高表达蛋白的可溶性； （3）.宿主细胞的遗传，高表达热休克蛋白一有利于表达蛋白的可溶性； （4）异源蛋白的氨基酸序列；改变氨基酸序列可改变其溶解性。

  26. 3.包涵体的分离检测 菌体破碎 离心收集 清洗 高速研磨 高压匀浆 差速离心 去污剂处理。如TritonX-100,SDS,脱氧胆盐

  27. 4.包涵体表达系统的构建 将启动子和SD 序列安装在外源基因的5‘端即可。一般现在都有商业的表达载体卖，只要获得相应的载体，将外源基因正确的连接上去即可。

  28. （二）分泌性表达 大肠杆菌中的表达蛋白或是留在细胞质中，或是分泌在细胞周质（细胞质与外膜之间）中，或是细胞外膜进入培养基中。作为基因工程产物，要使之分泌到培养基中，需要通过特殊的技术处理。

  29. 1.分泌型蛋白表达方式有以下优点： （1）.蛋白分泌到细胞外，使之稳定性提高，主要是避免了蛋白酶的降解作用； （2）.简化了后续的纯化过程，因为培养基中的成分都是蛋白分解物，在培养基中基本只有表达产物，其他成分是小分子，通过简单的分离纯化即可； （3）.分泌蛋白的信号肽将被切除，外源蛋白与信号肽相连，在信号肽被切除时，N-端甲硫氨酸残疾可以被切除。

  30. 2.蛋白质分泌的机制 表达蛋白的分泌分2类： （1）共翻译传递：原核细菌的分泌型蛋白的N-端有15—30个氨基酸残疾组成的信号肽（signal peptide),N-端前面几个残基为极性氨基酸，中部及后部为连续排列的疏水残基，它对蛋白质穿过疏水性的细胞膜是极为重要的。 （2）翻译后运输：分子伴娘(chaperone)SecB与新合成的蛋白结合,并控制其构想折叠；SecB与固定在内膜上的SecA结合；SecA与SecE和SecY复合体相连，在ATP的作用下，SecA将蛋白前体推入内膜，同时释放SecB因子；最后内膜分泌系统的信号肽酶切除信号肽序列，蛋白质被分泌到细胞周质中。

  31. 3.分泌型蛋白表达系统的构建 将分泌型蛋白的信号肽，如细菌的抗菌素的酶类蛋白的信号肽，连接到外源基因的上游即可构建成分泌型表达系统。

  32. （三）融合型异源蛋白表达 将外源基因与载体上的蛋白基因（来自与受体细胞）连接在一起，形成一个编码框，一起表达。在内源蛋白和外源蛋白之间设计一个蛋白酶切位点，表达产物用蛋白酶切断，获得独立的外源蛋白。

  33. 1.融合蛋白表达的特性 ： （1）融合蛋白由于内源蛋白部分能正确折叠，减少被蛋白酶降解的可能性； （2）利用内源性蛋白部分的抗体、配体和底物特性进行分离纯化； （3）表达效率较高，通常选择的受体菌基因都是高表达基因，包括所有的与表达效率有关的因素都是相对较优的，所以表达效率很高，外源基因与内源基因一起高效表达，可提高表达效率。

  34. 2.融合表达体系的构建 构建融合表达体系需要考虑以下因素： （1）内源基因必须是高效表达的，并且配套以纯化方案； （2）外源基因位于内源基因的下游，并有相应的终止密码； （3）并非用完整的内源基因，以避免内源蛋白和外源蛋白的大小基本相同，使之在电泳分离是困难； （4）内源和外源蛋白之间设计有裂解位点； （5）外源基因与内源基因连接时阅读框要正确。

  35. pMAL™蛋白融合表达及纯化系统(Protein Fusion & Purification (pMAL™) System)

  36. pMAL™系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。通过"tac"强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达（1，2，3），并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化（4）

  37. MBP-paramyosin-△Sal 融合蛋白表达及纯化的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果A: Lane 1:未诱导菌 Lane 2:诱导表达菌B: Lane 1:过amylose柱，麦芽糖洗脱后的纯化蛋白, Lane 2:经Factor Xa切割后的纯化蛋白, Lane 3:经amylose柱二次洗脱后的paramyosin片段

  38. （四）寡聚型异源蛋白的表达 提高重组质粒的拷贝数可以提高表达水平，但提高拷贝数后，由于重组质粒上其它基因的表达，消耗宿主细胞的能量，导致宿主细胞的生长受到影响，以致表达水平反而下降。 另一种策略是将多个外源基因拷贝串联克隆在低拷贝的质粒上，形成寡聚型外源蛋白表达系统

  39. 寡聚型异源蛋白的表达系统的构建策略： 1.多表达单元型重组：每个独立的表达单元包括启动子、终止子、SD序列、起始和终止密码子。多个这样的独立表达单元串联起来。每个单元可以是同向也可以是反向。每个单元表达的蛋白分子也是独立的。表达产物不需断裂处理，其中的N-端甲硫氨酸没有除去。适合表达较大的蛋白质。

  40. 寡聚型异源蛋白的表达系统的构建策略 2.多顺反子型重组：每个拷贝有各自的SD序列、起始和终止密码子，这样多个拷贝置于一个启动子和终止子之间，以一条mRNA分子的形式转录，但是独立地翻译。 3.多编码序列型重组：多个拷贝序列串联起来置于一套启动子、终止子、SD序列、起始和终止密码子的控制之下，在接口处设置溴化氰能断裂的甲硫氨酸。产生一个多个蛋白分子串在一起的蛋白分子，产物经溴化氰处理，获得独立的蛋白分子。

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