第十二章

第十二章 分子生物学常用技术及其应用

序言 21世纪是生命科学的世纪！生物技术是当今发展最快、最活跃、对社会与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其中基因工程和发酵工程是生物技术的核心。世界各国政府高度重视生物技术我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、新材料等高科技领域的第二位。可见其战略地位。生物技术正在改变人们的生活和观念随着基因组计划的接近完成及后基因组计划的开展，借助计算机处理复杂信息的强大能力，21世纪的生物技术将会有更大发展，有些领域甚至可能有重大突破。

第一节自然界的基因转移和重组 一、接合质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞二、转化通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞获得新的遗传表型三、转导病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞，使后者获得新的遗传表型四、转座 DNA片段从染色体的某处移位到另一处。

四、基因重组(recombinant) 不同DNA分子间发生的共价连接重组的类型： • 位点特异性重组 (site-specific recombination) 2. 同源重组（homologous recombination）

A B A a B A b B a b a b A a b A B b B a 1. 同源重组（homologous recombination）机制同源区功能 1. 在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。 2. 是DNA损伤修复的重要机制之一。

2. 位点特异性的基因重组 由整合酶催化，重组仅在特定的基因片段和位点上进行。是免疫球蛋白多样性的分子机制。

第二节 基因工程的工具——工具酶和载体

一、常用的工具酶 (一)限制性内切酶(restriction endonuclease) ---切——基因工程的手术刀没有限制性内切酶的发现和应用，就很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。识别双链DNA中特异序列，该序列的特征为4-6个核苷酸的回文结构，并在识别序列内或附近特异切割DNA，产生粘性末端或平末端。功能：根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子

3′ 5′ **********GAATTC******** **********CTTAAG******** 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ —OH *********G A A T T C********* P — G********* OH— P *********C T T A A 3′ 5′ 3′ 5′ 作用模式图： 1. 产生5′突出粘性末端(sticky end) EcoR I

5′ 3′ **********CTGCAG************** **********GACGTC************** 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ — —OH *********C T G C A G*********** P OH— A C G T C*********** *********G — P 3′ 5′ 3′ 5′ 作用模式图： 2. 产生3′突出粘性末端 Pst I

5′ 3′ *************AGCT************* *************TCGA************* 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ — —OH CT************* *************AG *************TC P GA************* OH— — P 3′ 5′ 3′ 5′ 作用模式图： 3. 产生平末端(blunt end) Alu I

限制性内切酶用途： • 基因重组过程中切割DNA以获取目的基 • 因片段，切割载体形成切口，使目的基因能插入载体中。 2.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP)分析：遗传病的诊断，法医 DNA指纹分析等。 3.构建DNA的物理图谱，基因定位，DNA的同源性分析等等。

(二)DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5′磷酸基团与3′羟基形成磷酸酯键。功能：将两条双链DNA片段连接起来，实现 DNA的体外重组。

DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA，但效率很低。如需连接单链DNA或RNA，则需用RNA连接酶。

5′ 3′ 5′ 3′ — A A T T C********* —OH *********G P G********* OH— *********C T T A A — P 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ **********GAATTC********** **********CTTAAG********** 5′ 3′ DNA连接酶作用模式图： 1. 连接粘性末端 DNA连接酶 EcoR I

5′ 3′ 5′ 3′ —OH — ************TC ************AG CT************* P — GA************* OH— P 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ *************AGCT************** *************TCGA************** 3′ 5′ 作用模式图： 2. 连接平末端 DNA连接酶 Alu I

(三) 反转录酶(Reverse Transcriptase) 功能： 1. RNA指导的DNA聚合酶活性：以RNA为模板，以带3′-OH末端的DNA片段为引物，沿5′至3′方向合成DNA链。 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT—OH 3′ dNTP Mg2+ 反转录酶 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT AGACAGGAT……3′

功能： 2. DNA指导的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H活性；DNA解旋酶活性等。用途： 1. 反转录酶的最主要作用是以mRNA 为模板合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)。 2. 以单链DNA或RNA为模板制备探针。

(四) 核酸酶S1 功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。核酸酶S1 核酸酶S1 + 核酸酶S1

(四)核酸酶S1 用途： 1. 除去双链DNA的粘性末端以产生平末端； 2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构； 3. 分析RNA的茎环结构以及DNA- RNA分子的杂交情况等。

催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。功能： • 底物是单链DNA或有3′突出末端的 • 双链 DNA。 Mg2+ 3′ 3′ 5′ 5′ OH (A、G、C、T)n nppi dNTP Mg2+ OH (A、G、C、T)n 3′ 3′ 5′ 5′ dNTP nppi

2.底物是平端或3′ 凹端的双链DNA。 3′ 5′ 3′ 5′ Co2+ OH (A、G、C、T)n nppi dNTP Co2+ OH (A、G、C、T)n 3′ 5′ 3′ 5′ dNTP nppi

用途： 1. 主要作用是在载体或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。 2. DNA 3′末端的同位素标记。

(六) 核糖核酸酶H 功能：水解DNA-RNA杂交分子中的RNA链。核糖核酸酶H RNA DNA DNA 用途：用核糖核酸酶H部分水解mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，使未被水解的mRNA作为引物合成cDNA的第二链。

二、载体(vector) • 目的基因进入原核或真核细胞并高效复制 • 和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。 • 作为基因工程载体所需具备的基本条件： 1. 能自我复制，并具一定的拷贝数。 2. 带有抗性基因，便于筛选和鉴定。 3. 在适当的位置有单酶切位点，便于重组操作。 4. 带有强启动子，驱动目的基因在宿主细胞内高效表达。

基因工程载体的种类和用途： 1. 细菌质粒：最常用的用于目的基因克隆或表达的载体。 2. 噬菌体：主要用于构建基因组DNA或 cDNA文库。 3. M13噬菌体：专用于Sanger双脱氧DNA 测序 4.粘粒：用于克隆大片段DNA。 5.酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白。 6.病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物病毒。用于在真核细胞中表达目的蛋白。

(一) 质粒(plasmid) 定义:细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。质粒染色质细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌

pBR322质粒：一种克隆质粒 结构： ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。 Ampr,Tetr： Ampr 两个抗性基因用于筛选阳性克隆。 Tetr Pst I, BamH I： ORI 两个单酶切位点用于插入目的基因

pfxBlue: 克隆质粒 Ampr MCS MCS：Multiple Clonning Site 提供多个单酶切位点用于克隆操作 LacZ LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆

pRS426：原核细胞表达质粒 LacZ Ampr MCS P(LacZ) P(LacZ)： LacZ启动子用于在原核细胞驱动目的基因的表达。

pcDNA3：真核细胞表达质粒 Pcmv： CMV增强子/启动子驱动目的基因在真核细胞内表达 BGH pA：加尾信号目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。

(二) 噬菌体(phage) 1. 噬菌体(phage) 2. 粘粒(cosmid) 3. M13噬菌体

调控区 结构区裂解区 1. 噬菌体 cos位点 A WB DEF ZJ att xis N cl cro O P Q SR cos 位点重组区 EcoRI EcoRI EcoRI A R A R 目的基因插入型置换型

重组噬菌体的分子量必须在野生型噬 • 菌体分子量大小的75%至105%之间。筛选标记：蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。用途： a.用作一般的克隆载体。 b.用于构建基因组或cDNA文库。 c.用于抗体库或随机肽库的构建。

2. 粘粒(cosmid) 组成： 1. 质粒复制的起始位点(ORI)； 2. 抗性基因； 3. 用于插入目的基因的单个酶切位点； 4. 噬菌体的cos位点。可见，cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。

特点： • 可插入长达27～41kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。 • 加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将 • 粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。 • 粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体 • 的功能，而表现质粒的特性。

3. M13噬菌体 3′ 5′ 经pII蛋白造缺口复制复制型 DNA 噬菌体正链进入下一循环 5′ 3′ 3′ 经pII 蛋白剪切 5′ 滚环复制释出单链DNA(正链) 在细菌内的复制模式图

M13噬菌体几个重要特点： 1. M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降低宿主细胞的生长速度。 2. M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。 3. 克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。

M13噬菌体用途： 1. DNA序列测定； 2. 制备单链DNA探针； 3. 用于定点突变的研究。

第三节 基因工程的步骤

基因工程的基本步骤 1.基因工程的上游技术：基因重组 + 目的基因载体连接 + 转化、筛选和鉴定阳性克隆含重组子的阳性克隆分、切、接、转、筛

基因工程的基本步骤 2.基因工程的下游技术： (1)发酵工程发酵条件(生物反应器结构、细菌培养温度、空气通量、pH及培养基成分等)的优化组合。 (2)蛋白质的分离、纯化与质量鉴定

一、目的基因的制备—分 (一) 人工合成法(也即化学合成法) 本方法适用于分子量较小的目的基因 (100bp以内)。缺点： 1. 只能合成较小片段的DNA(100bp以内)。 2. 如目的基因DNA序列需通过氨基酸序列推测，难于保证与天然基因序列一致，往往导致表达效率大大降低。

(二)反转录法 本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。

(二)反转录法： 加热变性方案： TTnT 5′ AAnA 加入特异性引物 3′ 5′ mRNA 反转录酶 cDNA 3′ TTnT 5′ AAnA 3′ 5′ mRNA DNA聚合酶核糖核酸酶H cDNA 3′ TTnT 5′ DNA poly I 重复上述步骤核酸酶S1 扩增出大量的产物聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR) 双链cDNA

(三)直接从染色体DNA中分离 根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用合适的限制性内切酶切割染色体DNA，分离目的基因。 • 本方法较适用于制备原核生物目的基因，其原因为： 1. 真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，在原核细胞中转录后不能剪接。 2. 真核细胞的基因多数为单拷贝，难于分离到足够的目的基因。

(四) 从基因文库(gene library)中获取 基因组文库：G-文库 cDNA文库： c-文库 (常用) 方法：用目的基因上的一段 DNA做成探针与文库中的 DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。基因文库

二、构建DNA重组体---接 (一)粘性末端连接质粒目的基因用同一种或两种限制性内切酶酶切本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点 DNA连接酶重组质粒

(二)平末端连接 产生粘性末端的内切酶产生粘性末端的内切酶质粒产生平末端的内切酶核酸酶S1 目的基因核酸酶S1 DNA连接酶本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！重组质粒

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