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青枯雷尔氏菌种下分化及其病害检测分子探针的研究与应用

青枯雷尔氏菌种下分化及其病害检测分子探针的研究与应用. 报告人：车建美 研究人员 : 刘波博士、 蓝江林博士、朱育菁博士、林抗美研究员、 车建美硕士、郑雪芳硕士、肖荣凤硕士、周先治博士生、 葛慈斌博士生、林营志博士、苏明星硕士生、史怀硕士。 福建省农业科学研究院农业生物资源研究所 二 00 八年二月七日. 汇报内容. 项目简介 学术思想及研究基础 研究进展（ 2007 年度） 青枯雷尔氏菌的分子鉴定 青枯雷尔氏菌生理小种分化 青枯雷尔氏菌生化型分化 青枯雷尔氏菌脂肪酸型分析

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青枯雷尔氏菌种下分化及其病害检测分子探针的研究与应用

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  1. 青枯雷尔氏菌种下分化及其病害检测分子探针的研究与应用青枯雷尔氏菌种下分化及其病害检测分子探针的研究与应用 报告人：车建美 研究人员:刘波博士、蓝江林博士、朱育菁博士、林抗美研究员、 车建美硕士、郑雪芳硕士、肖荣凤硕士、周先治博士生、 葛慈斌博士生、林营志博士、苏明星硕士生、史怀硕士。 福建省农业科学研究院农业生物资源研究所 二00八年二月七日

  2. 汇报内容 • 项目简介 • 学术思想及研究基础 • 研究进展（2007年度） • 青枯雷尔氏菌的分子鉴定 • 青枯雷尔氏菌生理小种分化 • 青枯雷尔氏菌生化型分化 • 青枯雷尔氏菌脂肪酸型分析 • 青枯雷尔氏菌的基因型分化 • 青枯病害检测分子探针的研究与应用 • 研究的小结与创新点 • 发表论文 • 研究成果

  3. 项目简介 • 国家863：茄科作物青枯病和枯萎病生防菌剂的研究与应用（2006AA10A211），2006.10-2010.10 • 福建省科技厅：省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（STIF-Y03），2007.1-2007.12 • 福建省自然基金：生防菌对青枯雷尔氏菌微生态选择性致弱作用的研究（2006J0320），2006.5-2008.4

  4. 青枯病发生 青枯雷尔氏菌种下分化 致病性分化 致病机理 侵染植物能力 分子探针设计及验证 植物免疫接种剂 学术思想

  5. 学术思想 • 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的毁灭性土传病害，是最重要的作物病害之一。 • 在寄主范围、地理分布、致病特征、流行特征、种下分类等方面存在较大的差异，具有明显的多态性。 • 目前青枯雷尔氏菌存在着各种防治手段难以完全奏效的问题，与该菌复杂的异源性及组成类型复杂有关。 • 青枯雷尔氏菌致病性有明显的强弱之分，强致病性菌株可引起作物发病，甚至死亡，弱致病性菌株对作物并没有危害。

  6. 研究基础 • 对青枯雷尔氏菌的采集、分离、保存 、青枯雷尔氏菌在不同作物体内的分布、青枯雷尔氏菌的形态特征、青枯雷尔氏菌的培养与生长等微生物学特性进行了研究，出版专著《青枯雷尔氏菌的多态性分析》，发表文章25篇。 • 提出了青枯雷尔氏菌脂肪酸型，建立了判别模型。 • 建立了青枯雷尔氏菌分化的细菌色谱鉴定体系。 • 青枯雷尔氏菌在细菌色谱上有2 个峰，无致病力菌株是前峰高于后峰，而强致病力菌株后峰高于前峰。 • 吸附蛋白研究表明，无致病力菌株具有一条带，强致病力菌株有两条带。 • 设计了phcA 基因引物, 鉴别青枯雷尔氏菌强株、弱株进行了初步的检测。

  7. 一、青枯雷尔氏菌的分子鉴定 1、青枯雷尔氏菌的分子鉴定 根据青枯雷尔氏菌的标准菌株GMI1000 ITS1区序列（由Genbank上获取）设计引物扩增供试菌株的16S和23S之间的ITS1区序列，获得的序列进行同源比对，确定菌株的种类。

  8. 2、青枯雷尔氏菌的基因测序 一、青枯雷尔氏菌的分子鉴定

  9. 3、青枯雷尔氏菌ITS序列多态性 一、青枯雷尔氏菌的分子鉴定

  10. 4、青枯雷尔氏属各小种的亲缘关系 一、青枯雷尔氏菌的分子鉴定

  11. 二、青枯雷尔氏菌生理小种分化

  12. 三、青枯雷尔氏菌生化型分化 1、青枯雷尔氏菌生化型鉴定方法 接种于分别含有乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇的标准培养基里(由杭州天和微生物试剂有限公司提供)，观察供试菌株对3种双糖和3种六碳醇的利用情况，确定菌株的生化型。

  13. 三、青枯雷尔氏菌生化型分化 青枯雷尔氏菌生化型分化表

  14. 三、青枯雷尔氏菌生化型分化 2、青枯雷尔氏菌生化型分析

  15. 四、青枯雷尔氏菌脂肪酸型分化 1、青枯雷尔氏菌典型脂肪酸图谱 注：横坐标表示色谱分析时间，纵坐标表示色谱峰高值；第一个色谱峰为溶剂波峰

  16. 26 12 11 16 5 15 23 9 10 22 24 13 31 39 4 35 28 29 6 8 2 3 40 36 33 37 38 14 20 32 18 1 19 7 21 17 25 27 30 34 λ=6.00 欧氏距离 四、青枯雷尔氏菌脂肪酸型分化 2、青枯雷尔氏菌脂肪型分化 Group Ⅰ Group Ⅱ Group Ⅲ

  17. 五、青枯雷尔氏菌基因型分化 1、青枯雷尔氏菌的BOX-PCR多态性 不同寄主青枯菌的BOX-PCR电泳图谱

  18. 五、青枯雷尔氏菌基因型分化 2、青枯雷尔氏菌RAMS多态性分析

  19. 莆　田　 宁　德　 莆　田　 五、青枯雷尔氏菌基因型分化 3、青枯雷尔氏菌的聚类分析 宁　德　 。。。。。。。。。。。。。。。

  20. 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 1、青枯雷尔氏菌的弱化指数 弱化指数(N=D1/D2，其中N为弱化指数，D1和D2分别表示在TTC平板培养基上青枯雷尔氏菌细胞单菌落的红斑半径和菌落半径。 弱化指数的测定

  21. 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 2、青枯雷尔氏菌菌落形态分化 典型的强致病力青枯雷尔氏菌 典型的无致病力青枯雷尔氏菌

  22. 19个菌株的弱化指数介于0.60和0.80之间，发病率在6.7%-100%之间变动，为过渡性菌株19个菌株的弱化指数介于0.60和0.80之间，发病率在6.7%-100%之间变动，为过渡性菌株 17个菌株的弱化指数<0.60，回接发病率为100%，为强致病性菌株； 4个菌株的弱化指数>0.80，回接发病率为0，为无致病性菌株 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 3、青枯雷尔氏菌致病力检测

  23. 基因组编码5129 个可能蛋白，其中染色体上携带有基本生存必需的几乎所有蛋白 巨质粒上编码一些染色体上没有的控制初生代谢的酶类。 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 4、青枯雷尔氏菌的基因组结构 R. solanacearum基因组大小为5.8 Mb，包含两个复制子，即一个3.7 Mb 的染色体和2.1Mb 巨质粒。

  24. 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 5、青枯雷尔氏菌的致病机理 Ralstonia solanacearum采用十分复杂的调控网络来选择寄主范围和调控其致病性，主要包括一个核心调控网络和几个与核心调控网络有关的附属级联调控系统。核心调控网络是由5 类基因（phc、vsr、solR、XpsR 和epsR）控制的涉及到胞外多糖、细胞壁降解和R. solanacearum自身信号分子反应的综合体系。，phcA 基因在这一调控系统中起到了类似一个开关的作用。 Ralstonia solanacearum 的Phc 调控体系的可能途径（引自Schell, 2000）

  25. 引物二：phcA3：5’-CGACAACGAGTGGGGCTACTCGAAC-3’ phcA4：5’-GGAAGG CGTTGAGGTTGT-3’ 引物三：phcA5：5’-TGCCTTTCCACCTTCTGT-3’ phcA6：5’-AGGCGTTGAGGTTGTAGGC-3’ 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 6、青枯雷尔氏菌致病力检测分子探针的设计 不同引物对Rs-T.1.2-010618-07V、Rs-T.1.2-010618-07V- Bs-8093-1的PCR扩增产物电泳图 注：M：Marker（100bp DNA Ladder）；1： Rs-T.1.2-010618-07V（由引物二扩增，1220bp）；2：Rs-T.1.2-010618-07V（由引物三扩增，837bp）；3：Rs-T.1.2-010618-07V- Bs-8093-1（由引物二扩增，1220bp）；4：Rs-T.1.2-010618-07V- Bs-8093-1（由引物三扩增）；5：Rs-T.1.2-010618-07V（由1μl phcA3、1μlphcA5和2μlphcA4扩增，1220bp和837bp）；6：Rs-T.1.2-010618-07V- Bs-8093-1（由1μl phcA3、1μlphcA5和2μlphcA4扩增，1220bp）；7：Rs-T.1.2-010618-07V（引物二和引物三扩增，1220bp和837bp）；8：Rs-T.1.2-010618-07V- Bs-8093-1（引物二和引物三扩增，1220bp）；9：Rs-T.1.2-010618-07V（未加引物）；10：Rs-T.1.2-010618-07V- Bs-8093-1（未加引物）。

  26. phcA3：5’-CGACAACGAGTGGGGCTACTCGAAC-3’ phcA4：5’-TGCCTTTCCACCTTCTGT-3’ phcA5：5’-GGAAGGCGTTGAGGTTGT-3’ 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 7、青枯菌致病力检测分子探针的验证（1） 三条引物对强致病力青枯雷尔氏菌的PCR扩增产物电泳图 注：M：Marker（100bp DNA Ladder）；1-23：不同寄主分离的青枯雷尔氏菌强致病力菌株；24：GM1000

  27. phcA3：5’-CGACAACGAGTGGGGCTACTCGAAC-3’ phcA4：5’-TGCCTTTCCACCTTCTGT-3’ phcA5：5’-GGAAGGCGTTGAGGTTGT-3’ 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 8、青枯菌致病力检测分子探针的验证（2） 三条引物对不同致病力青枯雷尔氏菌的PCR扩增产物电泳图 注：M：Marker（100bp DNA Ladder）；1-4：青枯雷尔氏菌强致病力菌株；5-24：青枯雷尔氏菌无致病力菌株

  28. phcA3：5’-CGACAACGAGTGGGGCTACTCGAAC-3’ phcA4：5’-TGCCTTTCCACCTTCTGT-3’ phcA5：5’-GGAAGGCGTTGAGGTTGT-3’ 六、青枯病害检测分子探针的研究与应用 9、青枯菌致病力检测分子探针的验证（3） 菌株1-16均扩增出1200bp左右和800bp左右的两条带，菌株17-30只扩增出1200bp左右的1条带。菌株1-16的发病率均为100.0%，是强致病力菌株，菌株17-30的发病率为0.0，是无致病力菌株。利用这3条引物可以很好的区分致病性菌株和无致病性菌株。

  29. 七、研究小结与创新点 • 1、研究小结与创新点 • 对青枯雷尔氏菌进行了ITS序列的比较分析 • 分析了青枯雷尔氏菌的种下分化特性 • 建立了青枯病分子检测探针，并对其进行了初步的验证 • 2、后续研究 • 进一步验证青枯病病害检测的分子探针的应用与灵敏度。 • 植物免疫机理研究，植物非特异性免疫指标测定，包括接种无致病力菌株后植株酶的变化，phcA基因探针，EPS 测定等等。 • 植物免疫接种剂生产工艺、制剂技术、保存技术、质量标准、使用技术等。

  30. 八、发表的论文 刘波，朱育菁，林抗美，肖荣凤，葛慈斌，蓝江林，冒乃和．青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性研究．中国农业科学．2007，40（7）：1559-1566 王秋红，陈 亮，林营志，朱育菁，蓝江林，杨淑佳，刘波．福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究．中国农业科学，2007，39（8）：1675-1687． 车建美，蓝江林，刘波. 青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）绿色荧光蛋白标记研究. 中国农业科学（已接收） 郑雪芳，蓝江林，曹宜，肖荣凤，葛慈斌，刘波. 瓜类作物枯萎病病原菌的分类鉴定及其ITS序列差异性分析. 中国农业科学（已接收） 郑雪芳，车建美，林营志，蓝江林，刘波.基于ITS序列和RAMS标记分析青枯雷尔氏菌的遗传多样性. 农业生物技术学报（已接收）

  31. 九、研究成果 • 新增科研项目25个，新增科研经费合计482.90万元。 • 申请专利2项 • “高效生物杀虫剂BtA研制”获得2006年福建省科技技术奖二等奖 • 获得农药登记证一个 • 发表文章15篇（其中国家级学报6篇） • 出版著作3本 • 完成试验报告198篇 • 培养博士后4名，培养博士研究生7名，硕士研究生18名；晋升研究员2名，晋升副研究员5名，晋升助理研究员6名。

  32. 谢 谢！

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