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Flowering. Cosa induce la fioritura Come avviene la transizione da stadio vegetativo a stadio fiorale Il Meristema Apicale Vegetativo Il Meristema Apicale Fiorale Il differenziamento degli organi fiorali Ruolo dei geni omeotici: il modello ABC. TRANSITION TO FLOWERING.

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Presentation Transcript
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Flowering

  • Cosa induce la fioritura

  • Come avviene la transizione da stadio vegetativo a stadio fiorale

  • Il Meristema Apicale Vegetativo

  • Il Meristema Apicale Fiorale

  • Il differenziamento degli organi fiorali

  • Ruolo dei geni omeotici: il modello ABC


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TRANSITION TO FLOWERING

4 pathways regolano questo processo

1) Vernalizzazione

2) Fotoperiodo

3) GA

4) Autonomo

1-2 regolano il flowering in risposta a segnali ambientali

3-4 agiscono in modo indipendente dagli stimoli ambientali


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  • Arabidopsis è una long-day facoltativa

  • Il pathway di fotoperiodo induce fioritura in risposta all’aumento del rapporto giorno/notte

  • Il pathway di vernalizzazione rende Arabidopsis competente alla fioritura dopo esposizione a basse temperature per un lungo periodo

  • Il pathway autonomo reprime la fioritura costitutivamente

  • Il pathway delle gibberelline induce la fioritura e le GAs sono necessarie in condizioni di fotoperiodo non-inducing

  • C’è variazione nei tempi di fioritura fra ecotipi di Arabidopsis: late-flowering senza vernalizzazione v/s gli early-flowering, si differenziano per variazione allelica nei loci FRI e FLC. I primi hanno alleli FRI e FLC dominanti, gli altri hanno alleli fri e flc non funzionali o deboli


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VRN2

VRN1

metilazione/remodeling cromatina

Pathway

Autonomo

FPA FVE

FY FCA

LD FLD

FRI

FLC

azioneGA

Saccarosio

LFY

Fase Vegetativa

Fioritura

Vernalizzazione


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Vernalizzazione

Complesso PAF1

Pathway autonomo

Fotoperiodo

FLC

SOC1

Gibberelline

LEAFY

AP1

Transizione fiorale

FT


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  • FT:

  • piccola proteina globulare di 20 kDa, espressa nei tessutii floematici di cotiledoni e foglie

  • è un target diretto di CO, regolatore trascrizionale del pathway di fotoperiodo

  • il ruolo di FT come promotore del flowering è conservato in Arabidopsis e riso

  • è a valle di FLC e, in particolare, del pathway di fotoperiodo di induzione della fioritura

  • la sua attività è regolata da FD, una proteina bZip

  • FT e FD sono sufficienti ad attivare l’espressione dei geni marcatori fiorali (floral meristem identity genes)

  • Come FT regola l’attività di FD?


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  • FD:

  • identificata mediante “two-hybrid”, come “interactor” di FT

  • FD è necessario per l’attività di FD

  • FT e FD sono sufficienti per attivare l’espressione dei geni marker del flowering

  • FT agisce nel nucleo in un complesso contenente FD direttamente sui promotori dei geni target (chIP)

  • E’ noto da tempo che il fotoperiodo è percepito nelle foglie, che rilasciano un segnale sistemico, il così detto “florigeno”.

  • FT è espresso, tramite CO, nel floema fogliare, ma la sua attività nel complesso FT-FD avviene nel meristema apicale

  • L’ipotesi più semplice è che l’induzione di FT nel sistema vascolare fogliare porti alla presenza della proteina FT nel meristema apicale

  • Alternativamente, l’espressione di FT nelle foglie può attivare un “florigeno” che induce l’espressione di FT nel meristema


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  • Transizione da stadio vegetativo a stadio fiorale regolata da fattori ambientali e di sviluppo

  • Vernalizzazione: acquisizione della capacità alla fioritura in seguito a trattamento a freddo

  • il segnale di vernalizzazione deve essere trasmesso attraverso diversi cicli di divisione cellulare, NON è però trasmesso alla progenie

  • FLC, FRI:repressori di fioritura

  • FRIagisce interagendo con FLC

  • FLCregolato sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale, rappresenta il segnale che è inibito dalla vernalizzazione


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  • Vernalizzazione da fattori ambientali e di sviluppo:

  • non è graft-trasmissibile

  • effetti mitoticamente trasmissbili, NON trasmessi alla meiosi

  • VRN1/2:responsabili del mantenimento dello stato di vernalizzazione

  • VRN1codifica per una Myb-related DNA binding protein

  • VRN2codifica per una proteina di tipo Polycomb (Enhancer of zeste-like), zinc-finger, localizzata nel nucleo, necessaria per la stabilizzazione della repressione di FLC

  • Il complesso contenente VRN1/2 ha attività dimetilasi istonica


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  • Vernalizzazione da fattori ambientali e di svilupposupera l’effetto di FRI, reprimendo l’espressione di FLC  repressione epigenetica di FLC

  • FLCè espresso principalmente in zone mitoticamente attive

Memoria Cellulare della Vernalizzazione

 dovuta a struttura cromatinica alterata in FLC

  • La recente caratterizzazione di regolatori positivi e negativi di FLC ha mostrato che alcuni di loro sono coinvolti nella modificazione cromatinica di FLC. Queste modificazioni cromatiniche rappresentano un livello ulteriore di regolazione dell’expressione genica


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  • VRN1 e VRN2 da fattori ambientali e di sviluppohanno profili di espressione più “ampi” di FLC e NON sono regolati dalla vernalizzazione

  •  come possono reprimere FLC solo in seguito a vernalizzazione?

  • VIN3(Vernalization insensitive 3)

  • è indotto da freddo e di conseguenza FLC viene represso

  • VIN3 codifica per una HD protein.

  • Insieme a VRN1 (Myb TF) e a VRN2 (EnZeste) puo’ partecipare al remodeling di FLC


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Modello di Silencing di FLC da fattori ambientali e di sviluppo

mediato da vernalizzazione

FLC attivo:H3 acetilato

FLC inattivo:H3 deacetilato

il complesso HDAC/VIN3 lega H3 deacetilato

il complesso VRN1/VRN2 metila H3 in Lys 9 e 27

il complesso VRN1/VRN2 lega stabilmente H3, mantenendo lo stato di repressione

HP1 (Heterocromatin Protein1) lega H3 deacetilato, contribuendo al silenziamento di FLC


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Ac da fattori ambientali e di sviluppo

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

H3

H3

H3

H3

H3

H3

FLC

winter

Inactive

FLC

HDAC

VIN3

HDAC

VIN3

HDAC

VIN3

winter

Active

H3

HDAC

VIN3

Histone deacetylase complex

Histone H3


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H3 da fattori ambientali e di sviluppo

H3

H3

FLC

HP1

HDAC

VIN3

HDAC

VIN3

HDAC

VIN3

spring

HP1

HP1

MEK9/27

MEK9/27

MEK9/27

MEK9/27

MEK9/27

MEK9/27

H3

H3

H3

FLC

Ez

VRN1/2

Ez

VRN1/2

Ez

VRN1/2

Ez

VRN1/2

Ez

VRN1/2

Ez

VRN1/2

Ez

VRN1/2

Inactive

Stable

repression

Heterocromatin Protein1

Lega H3 dimetilato

Enhancer of zeste-like

VRN1/VRN2

HP1


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Attivazione dell’espressione di FLC da fattori ambientali e di sviluppo

La trimetilazione dell’istone H3 su Lys4 (H3-K4) è associata con la cromatina di geni attivi

La metilazione di H3-K4 avviene a 3 livelli: mono, di e trimetil

In lievito e Drosophila, la presenza di un K4 trimetilato definisce uno stato attivo di espressione genica

Come????

In lievito, l’ RNAPol Associated Factor1 (PAF1) si associa con il complesso RNA polimerasi II durante la trascrizione. Il suo ruolo è di recrutare SET1, una H3-K4 metiltrasferasi, sui geni target. SET1 determina la trimetilazione H3-K4 principalmente nella porzione 5’ delle regioni attivamente trascritte.


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  • Mostrano un aumentato livello di trimetilazione H3-K4 di FLC:

  • I mutanti late-flowering del pathway autonomo;

  • Le linee late-flowering che hanno un locus FRI forte

  • Quindi;

  • FRI promuove la trimetilazione H3-K4 della regione cromatinica di FLC, aumentando il livello di espressione di FLC

  •  I loci del pathway autonomo sono repressori di questa modificazione cromatinica

In Arabidopsis ci sono 5 geni “parenti” di FLC: FLM, MAF1, MAF3, MAF4 e MAF5

Come FLC, FLM e MAF2 sono repressori della fioritura ma, a differenza di FLC, reprimono la fioritura in condizioni di fotoperiodo non-inducing


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  • In lievito, esiste un solo gene per SET1, mentre Arabidopsis ha diverse potenziali H3-K4 trimetiletransferasi, basati su omologia di sequenza del dominio SET.

  • In particolare, mutazioni in Early Flowering in Short Days (EFS) comporta:

  • riduzione del livello di trimetilazione H3-K4 di FLC,

  • soppressione del late-flowering mediato da FRI

  • soppressione dell’espressione di FLC

  • EFSrecrutato da PAF1 per metilare i geni targets???


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In lievito ISW1p, proteina ATPasi chromatin-remodeling, preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p in vivo.

Un omologo di ISW1p di Arabidopsis, PIE1, è necessario per l’espressione di FLC.

PIE1 lega K4 trimetilate e rimodella la cromatina di FLC e dei suoi “parenti” per aumentare l’espressione genica.

Lievito ed Arabidopsis usano la trimetilazione H3-K4 in modo molto simile


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PolII preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

Il complesso PAF1 include:

ELF7, ELF8 e VIP4

E’ associato a

PolII

PolII

EFS

PolII

EFS

PIE1

PIE1

PolII

EFS

PIE1

PIE1

FLCmRNA

LOCUS FLC

Senza vernalizzazione

EFS

H3-K4 metiltransferasi

PIE1

Lega K4 trimetilato e causa remodeling ulteriore della cromatina di FLC e aumento della tracsrizione


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LOCUS FLC preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

dopo vernalizzazione

Stato eterocromatinico

No legame di PAF1


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Flowering preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

  • Cosa induce la fioritura

  • Come avviene la transizione da st. vegetativo a st. fiorale

  • Il Meristema Apicale Vegetativo

  • Il Meristema Apicale Fiorale

  • Il differenziamento degli organi fiorali

  • Ruolo dei geni omeotici: il modello ABC


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Shoot Apical Meristem preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

(SAM)

  • Ha 3 diverse attività:

  • automantenimento

  • produzione di foglie

  • formazione dello stelo

  • Diviso in 3 zone:

  • CZ (Central Zone)all’apice del meristema, scarsa attività di divisione cellulare,automantenimento

  • PZ (Peripheral Zone), circonda la central zone, % divisione cellulare alta,produzione di foglie

  • Rib (Rib Zone), dietro la central zone, % divisione cellulare alta,formazione dello stelo


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Differenziamento preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p come risultato del controllo didivisione cellulare(controllo dei piani di divisione) eallungamento/espansione cellulare

  • 3 strati clonali distinti nel SAM, caratterizzati da diversimarcatori molecolari

  • L1distinto già durante l’embriogenesi, pattern di divisioni cellulari anticlinali

  • L2pattern di divisioni cellulari anticlinali

  • L3divisioni cellulari secondo piani diversi, approvvigionamento delle cellule centrali


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Arabidopsis Shoot Apical Meristem preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

(SAM)

  • durante la fase vegetativa, contribuisce allo sviluppo dello stelo e dei primordi fogliari

  • durante la fase riproduttiva produce meristemi fiorali

  • Due classi di geni hanno un ruolo nel determinare i meristemi apicali e fiorali:

  • Geni Meristem-Structure:

  • STM (TF), CLV1/3 (recep. kinase)

  • Geni Meristem-Identity


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SAM preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

Strati clonali

Floral Meristem

L1

L2

L1, L2 e L3 partecipano tutte all’organogenesi

L1: epidermide di fusto, foglie, fiori

L2: mesodermide e cellule germinali

L3: tessuto vascolare

L3

Zone istologiche

CZ

PZ

PZ

RZ

SAM


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Meristemi apicale e fiorale preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

sono“indeterminati”in quanto mantengono la loro attività per un tempo indefinito

Geni regolativi

Controllano il destino/identità cellulare nel meristema fiorale. Nello sviluppo del fiore, il primo segno di differenziamento è l’attivazione dei geni MADS per l’identità degli organi

MADS family of transcription factors:

MCM1 (yeast),

AGAMOUS e DEFICIENS (Arabidopsis),

SERUM Response Factor (human)


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DNA preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

binding

K

MADS

C

I

dimerizzazione

multimerizzazione

K keratin-like

I intervening

C C-terminal

MADS-box Genes

  • I geni MADS sono dominanti non solo fra gli Organ Identity Genes ma sono anche presenti come Meristem Identity Genes, Intemediate genes, Cadastral genes ed anche come targets più a valle


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Cadastral preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

Genes

Fattori Ambientali

Late and Early

Flowering

Genes

FCA

LD

CO

AP2

Meristem

Identity

Genes

SUP

TFL1

AP2

LFY

CAL

AP1

BEL1

SIN1

ELF1

LUG

Intermediate

Genes

UFO

AGL2

AGL9

AGL4

AG

Organ

Identity

Genes

AP2

PI

AG

AGL11

AP3

AP1

A

D

B

C

GENI DOWNSTREAM

sconosciuti

TFs

MADS


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Organ Identity Genes preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

Geni omeotici

geni A: determinano i sepali

geni A + B: determinano i petali

geni B + C: determinano gli stami

geni C: determinano i carpelli

  • Appartengono alla famiglia dei geniMADS

  • EspressiSOLOnelle regioni del fiore in sviluppo dove è necessaria la loro attività

  • Come sono attivati i geni omeotici fiorali??

  • Come è regolata la loro espressione in regioni cosi delimitate spazialmente?


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Il modello ABC preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

Organi fiorali

Organ identity

Genes

LFY, TF Zn finger


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SUP preferenzialmente lega H3-K4 di e trimetilati e la metilazione cromatinica H3-K4 di certi geni attivamente trascritti è richiesta per l’associazione di ISW1p

LUG

AP2

AG

A AP1

AP2

B AP3

PI

C AG

2) Cadastral Genes

1) Organ

Identity Genes

SUP

LUG

AP2

AG

3) Floral Meristem

Identity Genes

  • Ogni verticillo (whorl) contiene espressione unica di 1/2 gruppi di attività dei geni 1

  • Le attività A e C si reprimono mutualmente, i.e. almeno alcuni dei geni delle attività A e C sono sia 1 (organ identity) che 2 (cadastral)


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Studi di genetica reverse sui geni MADS hanno evidenziato l’esistenza di altri 2 gruppi: D ed E

I geni con funzione D avrebbero un ruolo nello sviluppo dell’ovulo

I geni con funzione E avrebbero un ruolo di co-fattori che lavorano con i geni ABC nei 3 verticilli interni

b) I geni MADS rappresentativi di ogni gruppo degli organ identity genes. Questi loci sono membri della sottofamiglia MIKC di MADS


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1) Meristem Identity Genes l’esistenza di altri 2 gruppi: D ed E

Necessari per l’induzione dei geni della classe 3, sono regolatori positivi, i.e. la loro assenza comporta la conversione dei fiori in germogli

2) Cadastral Genes

Regolatori spaziali della classe 1, delimitando le “boundaries” di espressione, prevenendo quindi espressione ectopica di 3

3) Organ Identity Genes

Corrispondono ai geni omeotici selector di Drosophila. Controllano “organ identity” mediante attivazione dei geni downstream


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LEAFY (LFY)

  • In seguito è necessario per la normale espressione dei geni ABC

Queste due funzioni possono essere separate

  • Il mutante lfy ha fiori senza petali ne’ stami, e presenta organi foglie, sepali e carpelli-like

  • Ha un ruolo fondamentale nell’induzione degli “Organ Identity Genes” di classe B

  • L’ antigene LFY è stato individuato in cellule in cui il suo mRNA non è presente

  • La proteina LFY è attiva in queste cellule: attività “long range” di un TF esportato

  • La proteina LFY lega DNA in vitro, e funziona come attivatore trascrizionale