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第九章 後基因體時代
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第九章 後基因體時代

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  1. 第九章 後基因體時代 人類基因體的定序 功能基因體學 蛋白質體學proteomics (protein genomics) 結構生物學 structural biology 生物資訊學 bioinformatics 生物晶片 biochip

  2. 結構生物學 • 分子生物物理學為基礎 • 結合化學+分子生物學 • 測定生物大分子複合體的空間結構 • 重要性 • 以簡化的模型出發-掌握共通性質 • 現象學角度-歸納出特性 • 蛋白質3D結構決定未來新藥開發之進展 • 酸短開發時間 • 降低成本 • 較DNA序列定序困難多

  3. 分子結構解析方法 • 結晶X光繞射 • 蛋白質先純化→長晶→X光繞射→電腦計算→推出立體結構模型 • 需大量蛋白質(濃度10-60 mg/ml) • 核磁共振(NMR) • 解析分子量30 kDa以下蛋白質 • 以同位素C13、H1、N15為基礎 • 水溶液下解析、所需蛋白量少

  4. 蛋白質的純化 • 蛋白質性質 • 胺基酸性質 • 蛋白質組成 • 蛋白質功能 • 生物反應的催化作用、儲存、運輸 • 傳遞訊息、抗體、調控、結構 • 蛋白質分離與純化 • 分離與純化流程、樣品備製、蛋白質溶解性 • 蛋白質沈澱、 蛋白質變性、蛋白質電泳分離 • 酵素水解、蛋白質層析

  5. 蛋白質純化流程注意事項 • 防止蛋白質變性失去活性 • 大部分於低溫操作(4℃冷房) • pH 4-10之間操作 • 減少泡沫的產生 • 注意重金屬、有機溶劑、微生物污染、 • 蛋白質水解酵素 • 選擇有效的純化方法 • 純化過程中持續追蹤蛋白質活性 • 要純化那一個蛋白質?What ? • 為何要純化此蛋白質?Why ? • 由何種材料純化?Which ? • 由那一個生長期?When ? • 如何純化此蛋白質?How ?

  6. 蛋白質純化過程 • 可分為三個階段: • 粗萃取蛋白 (crude extract protein)︰ 胞外酵素→鹽析沉澱法、濃縮器濃縮 細胞內酵素→打破細胞(動物、植物、真 菌、細菌、酵母菌) • 部分純化 (partially purified)︰ 初步的純化,使用各種管柱層析法。 • 均質酵素 (homogeneous)︰ 目標酵素的進一步精製純化,可用製備式電 泳或 FPLC, HPLC 等。

  7. 蛋白質純化的方法 • 純化策略:善用分子各種特性 • 鹽溶鹽析:最經濟方便的純化 • 離子交換法:利用胺基酸分子電荷性質 • 斥水性交互作用:利用胺基酸水溶特性 • 膠體過濾法:依照蛋白質分子大小分離 • 親和層析法:最具專一性的吸附

  8. 胺基酸的分子特性 參考資料:www.sinica.edu.tw

  9. M 1 2 3 4 97 66 45 30 20 純化的蛋白質電泳圖

  10. 蛋白質結晶的方法 (Petsko, 2003)

  11. 蛋白質晶體的X光繞射圖 (Petsko, 2003)

  12. X光繞射的解析度 (Petsko, 2003)

  13. 查詢蛋白質結構的網站 http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

  14. 蛋白質結構資料庫中的結構數量

  15. 觀察蛋白質結構軟體 • Rasmol: 顯示速度快,但較難學。 • Cn3D: 閱讀 MMDB 資料時,可直接顯示預設之觀察模型 (NCBI) • Swiss PDB Viewer: 可將多個分子重疊比較,而且可配合ExPASy上建立模型的工具使用 • Chemscape ChimeTM: 瀏覽器上直接觀察 • WebLab Viewer?: 雖較慢,可是較易學習,而且又能將模型存為各種不同的模式,適合一般生物學者使用

  16. 蛋白質的立體結構一

  17. 蛋白質的立體結構二

  18. 蛋白質的立體結構三

  19. 蛋白質的立體結構四

  20. 蛋白質的立體結構五

  21. 生物資訊 • 查已知DNA、RNA及蛋白質排序、結構與功能 • 比較不同來源的DNA、RNA及蛋白質間的相似性 • 察看蛋白質的3D結構 • 種系關連演化性分析或分類分析 • 代謝途徑分析 • 單一核苷酸多型性

  22. 單一核苷酸多型性一 (single nucleotide polymorphism, SNP) 生物基因體內某一位置的單一核苷酸不同個體間並不一樣 • 500~1000鹼基會出現一個不同,個體差異約0.1%,目前定出大約370萬個 • 分為五大類 • r SNP-基因調控區 • c SNP-外顯子內有胺基酸的變化 • s SNP-外顯子內無胺基酸的變化 • i SNP-內含子區 • g SNP-基因領域以外

  23. 單一核苷酸多型性二 • 藥物基因體學中r SNP-基因調控區 和c SNP-外顯子內有胺基酸的變化這兩項與藥物開發較相關 • 重要性 • 增加生存機會(面對環境變遷)、體質差異? • 多基因疾病與藥物反應的指標 • 尋找不同種族之間SNP的差異性

  24. 生物資訊資料庫 • NIH成立的NCBI (GenBank) (national center for biotechnology information) • EMBL (European Molecular Biology Laboratory)-歐洲分子生物實驗室 • EMBnet ( European Molecular Biology network)-歐洲分子生物網 • DDBJ (DNA DataBank of japan)日本基因庫 • UK Sanger Center英國桑格中心 • 史丹佛大學基因體資源中心 • A Database of Drosophila Genes & Genomes 果蠅基因體中心 相關網站連結:http://mail.tajen.edu.tw/~tyhong/的碩一研究法

  25. DNA序列分析與基因預測 • 基本區域排比搜尋工具 BLAST (basic local alignment search tool) • 序列相似性分析 FASTA • 生物資訊與蛋白質體研究 • 蛋白質三度空間立體結構 vs 新藥開發 (protein data bank) • 生物資訊發展方向 • SNP vs 量身訂做藥物?

  26. 生物晶片 • 微陣列技術:運用半導體技術(矽晶片、玻璃、高分子) • 整合:機電、光電、生化、分子生物學 • 進行:醫療、環境、食品、檢驗、新藥開發、基礎研究 • 生物晶片的種類 • 基因晶片:以DNA或寡核苷酸為探針,與檢體的DNA片段產生雜交反應,可大規模篩選或監測 • 蛋白質晶片:以蛋白質為探針 • 實驗室晶片:整合相關功能,類似小型實驗室

  27. 生物晶片的種類 • 基因晶片 • 光蝕刻法:一個一個核苷酸慢慢接上,核苷酸越長,成功率愈低。Affymetrix公司 • 機器手臂點樣法:機器沾取DNA樣本,成本低,易污染 • 應用墨點或噴墨技術:優點速度快,但DNA樣本多則成本高 • 蛋白質晶片(尚在開發) • 蛋白質的純化技術 • 抗體與抗原的反應原理+螢光成色 • 晶片實驗室 • PCR晶片、毛細管電泳晶片

  28. 生物晶片圖例一

  29. 生物晶片圖例二 參考資料:http://www.fraunhofer.de

  30. 生物晶片圖例三 (Claudia Vorbeck, 2005)

  31. 生晶片的應用 • 藥物開發與藥理學研究 • 藥物是否可抑制基因表現或誘導抗病基因表現 • 不影響正常基因表現 • 差異表現基因的篩選 • 比較正常細胞與癌細胞的差異性 • 篩選腫瘤的標記基因 • 基因突變之解析 • 快速定出基因突變的位置或序列 • 例如Affymetrix推出的p53晶片篩選癌症高危險群 • 遺傳網路的建構 • 分析不同發育時期之動物胚胎 • 瞭解發育各階段基因的交互作用