1 / 54

【 】

高速逆流色谱技术 在天然产物分离中的应用. 【 】. APPLICATION OF HSCCC IN SEPARATION OF NATURAL PRODUCTS. 孔令义 教授. Prof. LING-YI KONG. 中国药科大学中药学院. Department of Natural Medicinal Chemistry China Pharmaceutical University, Nanjing. Nature. Column Chromatography.

raleigh
Download Presentation

【 】

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 高速逆流色谱技术 在天然产物分离中的应用 【 】 APPLICATION OF HSCCC IN SEPARATION OF NATURAL PRODUCTS 孔令义 教授 Prof. LING-YI KONG 中国药科大学中药学院 Department of Natural Medicinal Chemistry China Pharmaceutical University, Nanjing

  2. Nature Column Chromatography Thin Layer Chromatography 传统的天然产物化学研究工作 Traditional Research Work of Natural Products Chemistry

  3. 如何实现分离手段的多样化？ 如何提高研究 工作的效率？ 如何实现分离工作 的仪器化，自动化， 程序化？ 如何利用各种仪器 的互补功能设计新 的分离思路，创造新的分离手段？ 传统的天然产物化学研究工作，百分之九十左右的时间在 和一根柱子，一块板子打交道。 ? Where is the way out?

  4. 高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物工作者看到了一丝曙光……高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物工作者看到了一丝曙光…… Appearance of HSCCC …… Our hope ……

  5. 主要内容： Contents: ★ HSCCC分离天然产物方法学研究 ★ HSCCC分离香豆素类化学成分研究 ★ HSCCC分离黄酮类化学成分研究 ★HSCCC分离生物碱类化学成分研究 ★ HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 ★ HSCCC联用分离技术研究 Methodology research of HSCCC in separation of natural products Research of HSCCC in separation of coumarins Research of HSCCC in separation of flavonoids Research of HSCCC in separation of alkaloids Research of HSCCC in systematic separation of plant extract Research of HSCCC coupled with other instruments

  6. 研究思路 Research pattern 样品制备 HPLC分析方法的建立 HSCCC溶剂系统的选择(分配系数的测定) HSCCC分离条件优化及HSCCC分离纯化 化合物纯度测定 化合物结构鉴定 重要成分活性研究

  7. HSCCC分离天然产物方法学研究 Methodology research of HSCCC in separation of natural products

  8. 分离方法建立步骤： 1. 根据化合物极性、溶解性特点，结合同类型化合物研究文献，确定备选溶剂系统。 2. 建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 3. 由所建立的HPLC分析条件准确测定各目标化合物在备选溶剂系统中的分配系数。 4. 由分配系数估算相应保留时间，分离度及峰宽等色谱参数。 5. 选择性的选取具有适宜色谱参数的溶剂系统进行预试。 6. 优化预试条件，确立最佳条件。 Process of method development

  9. 正丁醇-醋酸-水 正丁醇-甲醇-水(缓冲液) 正丁醇-乙酸乙酯-水(缓冲液) 乙酸乙酯-水(缓冲液) 水溶性和强极性 氯仿-甲醇-水 乙酸乙酯-甲醇-水 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水) 中等极性(氯仿溶解) 天然产物 正己烷-乙腈 正己烷-甲醇-水 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水) 弱极性(正己烷溶解) HSCCC溶剂系统选择 Selection of solvent systems （皂苷、强心苷、黄 酮苷、多酚类等） （香豆素、醌类、苯丙 素、生物碱、黄酮等） （萜类、甾体、脂肪酸等）

  10. （上相） HPLC法测定分配系数的理论基础 Theoretical base of K-value determination by HPLC

  11. 分配系数(KD) 与保留因子(κ)关系研究 Relationship of KD and K VR＝VM＋ KDVS Κ＝（VR－VM）/ VM Κ＝KD（VS / VM） ＝KDφ Φ——相比

  12. 分配系数(K) 与分离度(Rs)关系研究 Relationship of K and Rs

  13. 0.82 1.27 2.02 3.00 4.48 5.13 HSCCC峰宽度与分配系数K的关系 Relationship of K and peak width

  14. 峰宽－分配系数关系图 保留时间－峰宽－分配系数关系图

  15. 分离度与分配系数关系 在螺旋管体积为300ml，相比为1，流速为2ml/min时， tM=75min K2/K1 >1.2：Rs>1.0, 两组分峰重叠小于2% K2/K1 >1.31：Rs>1.5, 两组分峰重叠小于1% 两组分分离程度的判断依据

  16. HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 HSCCC分离香豆素类化学成分研究 Research of HSCCC in separation of coumarins

  17. 前胡 Qian-hu • 1 化学成分研究进展 以香豆素类化合物为主 白花前胡: 以7,8-二氢吡喃骈香豆素类化合物为主 紫花前胡: 以6,7-二氢吡喃骈香豆素类化合物为主 • 2 药理研究进展 心血管系统保护作用 抗血小板凝集作用 抗过敏作用 祛痰作用 抗癌作用 白花前胡 P. praeruptorum Dunn. 紫花前胡 P. decursivum (Miq.) Maxim

  18. 白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HPLC色谱图 色谱柱：SPHERIGEL ODS C18 (250 mm × 4.6 mm I.D., 5 μm) 流动相：乙腈-水 梯度洗脱模式： 0-15 min，乙腈比例由50%线性变为60% 15-30 min，由60%线性变为70% 35min后，70%乙腈 色谱柱：SPHERIGEL ODS C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) 流动相：乙腈-水 梯度洗脱模式： 0-24min，50%乙腈 24-40min，乙腈由50%线性变为65%

  19. 分离条件的摸索 Separation condition 溶剂系统 Solvent system 流动相的流速 Flow rate 分离条件 梯度模式 Gradient mode 螺旋管的转速 Revolution speed 分离温度 Column temperature 针对香豆素类化合物具有较低极性的特点，采用经济适用环保的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:4～7:6～3)系统，流速1～2ml/min，分离温度20～35 C，根据等度洗脱各峰保留时间以及分离度决定是否采用梯度模式以及相应梯度条件。

  20. 白花前胡各溶剂系统的K值测定

  21. 紫花前胡各溶剂系统的K值测定

  22. 由 PW=11.726K 推算 及 白花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5）以及（5:5:6.5:3.5）较为合适，采用梯度洗脱可使各目标化合物均具有较好分离度，适宜的峰宽和保留时间。而紫花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4）效果较为理想。

  23. 白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HSCCC色谱图 • 螺旋管转速：900r/min • 流动相流速：2.0 mL/min • 分离温度：35C • 流动相梯度模式： 0-150min:石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5） 的下相 150-300min: 由5:5:5:5的下相线性变为5:5:6.5:3.5的下相 300min后: 流动相为5:5: 6.5:3.5的下相 • 螺旋管转速：900r/min • 流动相流速：2.0 mL/min • 分离温度：20C • 溶剂系统： 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4，v/v），上相为固定相，下相为流动相

  24. Journal of Chromatography A. 2004, 1057(1-2): 89-94. 2005, 1076(1-2): 127-32

  25. 小结： conclusion ★Pd-D-V 是首次以纯化合物形式分离得到，说明了HSCCC方法的分辨能力很高。 ★Ostruthin(欧芹素)首次从紫花前胡中分离得到。Ostruthin的含量并不低，但在以前的研究中未从紫花前胡中分离得到，这可能是由于该化合物在常规分离过程中易发生变化或易形成死吸附，这也说明了HSCCC方法的优越性。

  26. HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 HSCCC分离黄酮类化学成分研究 Research of HSCCC in separation of flavonoids

  27. 淫羊藿 Ying Yang Huo 系小檗科淫羊藿属植物(Epimedium koreanum Nakai.)的地上全草,主产于我国的辽宁、吉林等地 1 化学成分研究进展 8-异戊烯基取代的黄酮类化合物 2 药理研究进展 心脑血管、免疫系统、骨代谢、生殖系统等具有广泛的药理作用, 还有抗肿瘤作用 朝鲜淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai.

  28. 样品的制备 Preparation of sample 60C干燥 粉碎至约30目 1000g药材 10L70%乙醇回流提取2次 回收溶剂 浸膏上D101大孔 吸附树脂柱 水洗至无色，5L70%乙醇洗脱 减压旋转蒸发至干 11.5 g干粉

  29. HPLC分析方法建立 HPLC analysis 色谱柱：YWG C18柱(200 mm × 4.6 mm I.D., 10 μm)； 流动相：乙腈-水 0-12 min: 28%乙腈 12-20 min: 乙腈由28% 线性变为35% 30 min:35%乙腈 流动相流速：1.0 mL/min

  30. 由 PW=11.726K 推算 及 分离条件的摸索 Separation condition • 乙酸乙酯-水：Icariside II的纯度仅有68.2% • 乙酸乙酯-甲醇-水(5:1:5)： 只有icariin 的纯度较高，Icariside II 和 epimedokoreanoside I 的纯度较低，均不足80% • 当用乙酸乙酯-甲醇-水 (5:2:5)：所有的化合物的纯度均较差。 • 氯仿-甲醇-水系统： 根据黄酮极性特点，尝试采用乙酸乙酯-甲醇-水(5:0~3:5)，氯仿-甲醇-水(4:2.5~4:2)等体系： 适宜比例为4:3.5:2，此时各目标化合物均具有较好分离度，合适的峰宽和保留时间。

  31. 99.1% 98.2% 98.7% HSCCC色谱图 • 螺旋管转速：900r/min • 流动相流速：2.0 mL/min • 分离温度：25C • 溶剂系统： 氯仿-甲醇-水 4:3.5:2上相为固定相，下相为流动相 Journal of Chromatography A. 2005, 1064(1): 53-7

  32. HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 HSCCC分离生物碱类化学成分研究 Research of HSCCC in separation of alkaloids

  33. 吴茱萸 Wu Zhu Yu 为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.的近成熟果实，分布陕西、甘肃、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广东和广西等省区。秋季果实将近成熟尚未开裂时采收，除去果柄，晒干或烘干。 1 化学成分研究进展 主含生物碱：吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸因碱、羟基吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱。 2 药理研究进展 胃肠道作用，镇痛，中枢刺激，止血止泻等 吴茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth (E. rutaecarpa),

  34. HPLC分析方法建立 HPLC analysis 色谱柱：SPHERIGEL ODS C18 (250mm×4.6mm I.D., 5um) 流动相：甲醇-乙腈-水 0-22 min: 15:38:47 22-65 min: 45:38:17 流动相流速：1.0 mL/min 检测波长：254nm 吴茱萸乙酸乙酯超声提取物（生物碱部位）

  35. 由 PW=11.726K 推算 及 分离条件的摸索 Separation condition • 乙酸乙酯-水：生物碱基本分布于固定相中； • 乙酸乙酯-甲醇-水： 当甲醇含量稍高时系统不易分层； • 环己烷－乙酸乙酯－甲醇－水：在引入环己烷后改善了系统分层状况。其中甲醇比例较小时，出峰延迟，峰型过宽；甲醇比例较大时固定相保留不理想。 根据此类生物碱极性特点，尝试采用乙酸乙酯-水，乙酸乙酯-甲醇-水，环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5~7:5)等体系： 确定适宜比例为5:5:7:5。

  36. HSCCC色谱图 • 螺旋管转速：900r/min • 流动相流速：2.0 mL/min • 分离温度：25C • 溶剂系统： 环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 5:5:7:5上相为固定相，下相为流动相 Journal of Chromatography A, 1074 (2005) 139–144

  37. HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 Research of HSCCC in systematic separation of plant extract

  38. 天然药物的总提取物往往含有从脂溶性到水溶性的具有广泛天然药物的总提取物往往含有从脂溶性到水溶性的具有广泛 极性的一系列化学成分，若仅仅对其中主要成分进行HSCCC分离 ，不仅无法全面反映与活性相关的物质基础，而且以一种溶剂系统 也难以一次性实现彻底的分离。若采用传统的系统溶剂分离法，将 总提取物用不同的溶剂逐步划分为极性从小到大的不同部位，再针 对不同部位，使用不同HSCCC溶剂系统进一步分离，不仅可以加 快整体分离速度，而且有利于追踪主要活性部位，加大有效先导化 合物的发现几率，从而使得整个分离工作的系统性、针对性和完整 性得到了大大增强，最终将促进HSCCC技术成为天然产物化学研 究中的常规分离手段，加快天然药物化学研究现代化步伐。

  39. 何首乌 He Shou Wu 蓼科蓼属植物何首乌的块根，原植物广泛分布于四川、云南、河北、河南、山东、广东、广西、福建等省 1 化学成分 醌类化合物 二苯乙烯苷类化合物 2 药理作用 心血管系统、抗衰老、内分泌系统、消化系统、血液系统 抗肿瘤作用 抗病原微生物作用

  40. Separated fractions： 500g何首乌药材 5L 95%乙醇冷浸, 回收乙醇 浸膏(28g) 300mL水分散, 乙醚萃取 乙醚部位(8.0g) 水溶液 正丁醇萃取 水部位(10g) 正丁醇部位(7.5g) D101大孔吸附树脂, 30%乙醇洗脱 精制正丁醇部位(3.5g)

  41. HPLC成分分析 HPLC analysis 乙醚部位 精制正丁醇部位 Shimadzu VP-ODS柱 (150×4.6 mm I.D., 5 m)。 甲醇-水梯度洗脱，0-60min内甲醇由5%线性变为100%；1.2mL/min； 254nm。 Shimadzu VP-ODS柱 (150×4.6 mm I.D., 5 m)。 乙腈-水梯度洗脱，0-45min内乙腈由1%线性变为100%；0.8mL/min； 254nm。

  42. 分离策略 separation tactic • 乙醚部位: 主要为化合物I-IV • 采用分步洗脱的方法进行分离 先用正己烷–乙酸乙酯–甲醇–水（3:7:5:5）体系使I和II分离开 再用9:1:5:5体系的下相作流动相，将III洗脱出 IV则留在固定相中，回收固定相得到IV • 精制正丁醇部位: 主要为化合物V-IX • 用乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50)体系进行分离 先洗脱出V、VI、VII 改变HSCCC仪器螺旋管的旋转方向，同时将流动相变为 乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50)上相，将VIII和IX洗脱出。

  43. 乙醚部位 精制正丁醇部位(先) 精制正丁醇部位(后) 200min前流动相为正己烷–乙酸乙酯–甲醇–水（3:7:5:5）下相，200min后为9:1:5:5下相，600min后停机吹出固定相 乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50): 固定相：上相 流动相：下相 300min前正转 乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50): 固定相：下相 流动相：上相 300min后正转 HSCCC分离：获得不同极性的一系列化合物 Journal of Chromatography A. 2006, 1115: 64-71.

  44. HSCCC联用分离技术研究 Research of HSCCC coupled with other instruments

  45. 检测仪器 UV-VIS、RID、ELSD 分离仪器 HSCCCn、 PHPLC、SFE 分析仪器 IR、 MS、 TLC、 HPLC-DAD

  46. 目前进行HSCCC联用研究时需要考虑以下问题： 1．连接问题： 目前仅借助通用分流阀来实现。没有专门的接口技术，也没有实现接口的模块化和自动化。 2．流动相问题： HSCCC适用的溶剂范围十分宽泛, 但与之相连的仪器溶剂范围并不宽泛。 3．分流问题： 对于不同检测限的设备，为了达到不同的目的（分析或者制备），需采用不同的分流比。 4．杂质的影响：在LC-M S过程中, 复杂样品经分离后再进行质谱分析, HPLC的分离情况对M S检测带来较大影响。对于HSCCC-M S联用分析而言, 同样须经HSCCC分离, 且效果好才能得到满意的质谱信息。 5．样品量：HPLC-FT-IR的联用一直受到HPLC流动相吸收红外光谱的困扰。采用HSCCC能够获得高溶质－溶剂比的流出物，从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解。但是，它需要较大的样品量（每组分0.2～1mg甚至更多），这就限制了HSCCC-FT-IR在天然产物的研究，尤其是在复杂粗提物的分离分析中的应用。

  47. 天然药物化学成分复杂，有一部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收。加上色谱分离的困难以及流动相带来的干扰，使用传统的UV-VIS对其进行检测分析十分困难。作为通用型质量检测器的ELSD在某种程度上弥补了这方面的不足，被广泛的应用于皂苷类成分、糖类成分、内酯类成分、部分生物碱类成分以及其他一些成分的分析，取得了满意的结果。再加上其接口简单、连接方便的特点，已成功用作高效液相色谱，超临界流体色谱和逆流色谱的检测器。并已经被广泛应用于医药、化工、食品等行业。天然药物化学成分复杂，有一部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收。加上色谱分离的困难以及流动相带来的干扰，使用传统的UV-VIS对其进行检测分析十分困难。作为通用型质量检测器的ELSD在某种程度上弥补了这方面的不足，被广泛的应用于皂苷类成分、糖类成分、内酯类成分、部分生物碱类成分以及其他一些成分的分析，取得了满意的结果。再加上其接口简单、连接方便的特点，已成功用作高效液相色谱，超临界流体色谱和逆流色谱的检测器。并已经被广泛应用于医药、化工、食品等行业。

  48. 但是，ELSD作为一种通用型质量检测器，同时也是一种破坏性检测器，样品会被载气吹至废液瓶中，无法回收。因此需要借助分流阀的作用，牺牲一部分样品换取对分离过程的检测，分流比可按照需要调节。但是，ELSD作为一种通用型质量检测器，同时也是一种破坏性检测器，样品会被载气吹至废液瓶中，无法回收。因此需要借助分流阀的作用，牺牲一部分样品换取对分离过程的检测，分流比可按照需要调节。

  49. HSCCC-ELSD连接示意图 Sketch Map

  50. 为桔梗科沙参属植物轮叶沙参(Adenophora tetraphylla (Thunb.) Fisch)、沙参(A. stricta Miq.)的干燥根，分布较广，山东、江苏主产。 1 化学成分 甾醇类化合物 脂肪族化合物 2 药理作用 祛痰作用 强心作用 抗真菌作用 促进改善免疫系统作用 均无紫外吸收 南沙参 Nan Sha Sheng

More Related