第二节培养基的组成、配制与灭菌

第二节培养基的组成、配制与灭菌

一、培养基的组成和作用 培养基（medium）是植物组织培养的重要材料，是外植体生长的营养物质，只有配制出适宜的培养基，才能使组织培养获得成功。通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓度。

（一）矿质营养： 矿质营养又称无机营养，是指植物生长发育所需要的各种化学元素。

矿质元素的生理作用： （1）组成各种化合物，成为结构物质；（2）构成特殊物质，参与代谢；（3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等电化学作用；（4）影响形态发生和组织、器官的建成等。

根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5 mmol/l的元素称为微量元素。根据此规则大量元素种类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。其中C、H、O为气体元素，其余六种为矿质元素，分别占植物干重的百分数为18％、10％、70％、0.3%、0.07％、0.3%、0.3 ％、0.07%、0.05％。微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。

1、大量元素： 组织培养中，各种矿质营养主要从培养基中获得，N、P、K、Ca、Mg、S等6种大量元素依靠各种无机盐提供。不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同，需经试验确定。目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。其中以MS应用最广泛。以MS为例6中矿质元素分别由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2 .2H2O提供。

大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮的形式被使用，但铵态氮浓度过高会对有些植物培养物造成伤害，不适宜使用过高的浓度。而常用MS培养基中既有硝态氮又有铵态氮。大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮的形式被使用，但铵态氮浓度过高会对有些植物培养物造成伤害，不适宜使用过高的浓度。而常用MS培养基中既有硝态氮又有铵态氮。

2、微量元素： 植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如造成蛋白质变性、酶系失活。代谢障碍等。各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。

微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要作用，由于在较高pH下，FeCl3极易形成Fe（OH）3微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要作用，由于在较高pH下，FeCl3极易形成Fe（OH）3 沉淀，难以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。

（二）有机成分： 主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L, 通常用于原生质体等培养。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。

（三）植物生长调节物质： 植物激素是植物新称代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的用量直接影响植物细胞的分化、分裂以及发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。

常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素： 1、生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D 2、细胞分裂类：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip 3、赤霉素类：GA3、GA4、GA7 4、脱落酸：ABA 5、乙烯：ETH

1、生长素类： 主要促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。常用的有NAA、IAA、IBA、2，4－D等。

2、细胞分裂素类： 促进细胞分裂和扩大，促进茎增促，抑制茎伸长；诱导芽的分化、促进侧芽萌发；延缓衰老。常用细胞分裂素有BA、KIN、ZT、2ip等。

此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。如TDZ，CPPU，4－PU等。

3、赤霉素类： 主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；可以诱导离体成花；打破休眠等功能。常用GA3、GA4等。

4、脱落酸（ABA）： 促进休眠、衰老和脱落。组织培养中较少使用，主要用于调节激素平衡，促进形态建成。

5、乙烯： 主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。

（四）碳源： 碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在2－5％，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低直接影响形态建成。

（五）琼脂： 琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90 oC以上），成为凝胶，冷却后（40 oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在4～10g/L. 琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80％。

琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工工艺有关外，还受高压灭菌时的温度、时间以及pH影响。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工工艺有关外，还受高压灭菌时的温度、时间以及pH影响。

（六）有机附加物： 1、椰子汁：用量为100～200g/L。 2、香蕉泥：使用量为150～200g/L。 3、苹果汁、番茄汁等。

（七）其他成分： 1、活性炭：使用量为0 .2-1%。

2、抗生素： 常用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5～20mg/L。

3、抑制酚类物质形成的物质： （1）抗坏血酸：可以加入培养基或浸泡处理外植体。（2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：加入培养基中。

4、生长抑制剂： 常用矮壮素、比久（B9）、多效唑（pp333）、三碘苯甲酸、根皮酚等。

二、培养基的类型： 1、高盐浓度培养基：MS、B5、SH等。适用于多数营养需求量较大的植物。 2、中等盐浓度培养基：Nitsh、Miller等大量元素浓度约为MS的1/2。 3、低盐培养基：WPM、 White等。大量元素浓度约为MS的1/4左右。适用于木本植物的培养。

表1MS培养基的组成配方 组成成分数量(mg/l) 组成成分数量(mg/l) NH4NO3 1650 Na2-EDTA 37.3 KNO3 1900 FeSO4·7H2O 27.8 CaCl2·2H2O 440 CuSO4·5H2O 0.025 MgSO4·7H2O 370 蔗糖 30 KH2PO4 170 pH 5.8 KI 0.83 肌醇 100.0 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇 0.5 ZnSO4·7H2O 8.6 甘氨酸 2.0 Na2MoO4·2H2O 0.25 盐酸硫铵等 0.4 CoCl2·6H2O 0.025

表2B5培养基的组成和配方 组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO4·7H2O 27.8 CaCl2·2H2O 150 CuSO4·5H2O 0.025 MgSO4·7H2O 250 蔗糖 40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5 KI 0.75 肌醇 100 H3BO4 3.0 烟酸 1.0 MnSO4·4H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO4·7H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO4·2H2O 0.25 2,4－D 0.1－1.0 CoCl2·6H2O 0.025 盐酸硫铵 10 Na2-EDTA 37.3

组成成分 数量(mg/l) 组成成分 (mg/l) KNO3 2.3 Na2－EDTA 37.3 CaCl2·2H2O 166 FeSO4·7H2O 27.8 MgSO4·7H2O 185 蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO4·4H2O 4.4 盐酸硫铵 1.0 ZnSO4·7H2O 1.5 　　　表3 N6培养基的组成和配方

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