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快速扩增 cDNA 末端 ——RACE

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Presentation Transcript

  1. 快速扩增cDNA末端——RACE

  2. RACE的基本概念 • 不同厂家RACE试剂盒的介绍 • RACE技术的关键环节 • 存在的问题及解决办法

  3. RACE的基本概念 • cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法,为Frohman在1985年首次报道。 • 3’RACE 和5’RACE

  4. 3’RACE原理示意图

  5. mRNA (A)n (A)n 5’ 5’ 3’ GSP 5’ AAP AUAP 5’ 5’ GI … IG GI … IG 3’ AUAP 3’ CC…CC 5’ GSP2 nested GSP 3’ 5’ nested GSP 5'RACE原理示意图 5’ 3’ 3’CC…CC

  6. 不同厂家RACE试剂盒的介绍 • Invitrogen GeneRacerTM Kit • BD SMARTTM RACE

  7. RACE技术的关键环节 • RACE 技术的关键环节有2个: 1. 3个连续的酶促反应 (逆转录、TdT加尾、PCR扩增) TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)催化,它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端 2. RACE的引物 即使3个酶促反应均平稳顺利进行,但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。

  8. 存在的问题及解决办法 • 反转录 • RNA的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA,RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取,免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂,给试验带来麻烦。 • 反转录提前终止 模板中有特殊的二级结构,反转录提前终止。通过提高反转录的温度,加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上,避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构,以达到5’末端。

  9. 提供一种改进的反转录方法 • 在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分: • Oligo(dT)(0.5μg) 1μL Total RNA(4~5μg) 3μL DEPC-H2O To 25 μL 混匀,70℃保温10min;50℃保温5min;稍微离心一下。 • 在混合物中,依次加入以下成份: • 10X SSⅡ( SSⅢ)Buffer 5.0μL 10mM dNTP mix 1.0μL 0.1M DTT 2.0μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0μL DEPC-H2O To 24 μL 轻轻混合,在50℃保温5min后,在50℃下将3号管中的混合成分移入2号管中。 • 每个反应加入1μL SuperScriptTM Ⅱ(SSⅢ),轻轻混匀,50℃反应50min。 • 70℃放置15min以终止反应。 • -20℃保存。

  10. TdT加尾反应及其替代反应 • 首先在反转录后,一些无用的核苷酸和过多的cDNA引物的存在会干涉加尾的成功,降低目的cDNA加尾的有效性,从而导致第二链cDNA合成效率的降低。 • 其次,TdT反应难以控制,所有的cDNA都被加尾,而不管是否是全长cDNA,这样产生的非全长的cDNA将和全长产物一起完成PCR反应,而且会优先扩增,不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。

  11. TdT加尾反应及其替代反应 • 第三,若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区,则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始,产生非全长的第二条cDNA链。 • 我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒,采用PCR介导的连接反应,在一定程度上避免了以上的问题。 • RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾,这样在反转录合成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行,会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序,用TdT酶加上多聚T尾,结果降低了反转录的难度,两个基因最终均获得了完整的5’末端。

  12. RACE引物的设计 在实验过程中总结如下经验: • 引物不能设计在保守区简并引物区。 • 各引物之间尽量不要重叠,由于引物的重叠,会引起很严重的引物多联体现象,不能准确地扩增。 • 尽量多设计引物,以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物,便于鉴定的正确性。

  13. PCR扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题 • 一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定的、不需要的产物,有时甚至没有目的产物; • 另一方面,可能根本就没有扩增到任何产物。 增加PCR扩增效率,提高扩增产物的特异性解决方法: • 热启动PCR(hotstartPCR),长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touch-down PCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。 • 利用抑制PCR(suppression PCR)技术改进RACE程序,可大大减少非特异性的线性化扩增。 • 单引物的线性扩增问题:坚持做单引物对照,并减少引物的浓度。

  14. M 1 2 3 M 4 5 M 6 7 8 9 M:2000marker; 1:5GSP11+NAP; 2:NAP; 3:GSP 11; 4:5GSP22+AUAP; 5,7,9:AUAP; 6,8:5GSP44+ AUAP 图 多轮PCR扩增的电泳结果 Fig. Results of PCR amplified

  15. M 1 2 M 5 6 M 3 4 C A B A:The first PCR; BC:Nest PCR M:2000marker; 1:5GSP11+NAP; 2:NAP; 3:5GSP332+AUAP; 4,6:AUAP; 5:5GSP333+AUAP 图 多轮PCR扩增的电泳结果 Fig. Results of PCR amplified

  16. M 1 2 3 4 5 6 M M:2000marker; 1:3GSP441+AUAP; 3:3552+AUAP; 5:3IPCR2+AUAP 2,4,6:AUAP; 图 多轮PCR扩增的电泳结果 Fig. Results of PCR amplified

  17. 图5’RACE、3’RACE克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果图5’RACE、3’RACE克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果 Fig. The contig result of 5’RACE 、3’RACE and GsAP2 by software