实验二 . 小鼠骨髓细胞染色体标本制备

1. 实验二.小鼠骨髓细胞染色体标本制备 动物医学系兽医生物学教研室

2. 实 验 目 的 • 初步掌握小鼠骨髓细胞染色体标本制备，并对染色体进行观察

3. 实 验 原 理 1. 用适量的秋水仙素溶液注入动物体内，处于分裂期的细胞经秋水仙素处理，由于阻断了纺锤丝微管的组装，使细胞分裂停止于分裂中期，此时染色体具有典型的形态。 2. 骨髓中具有丰富的细胞，这些细胞具有很强的分裂活性，经秋水仙素处理后，可使分裂的细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本

4. 实 验 用 品 • 器材 • 解剖板、解剖剪、大小镊子、离心管、注射器、离心机、培养皿、恒温水浴锅、预冷载玻片、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸 • 试剂 • 200 ug/mL秋水仙素溶液、0.075mol/L KCl溶液、固定液（甲醇:乙酸=3:1）、Giemsa原液、生理盐水 • 材料 • 30g小鼠

5. 实 验 步 骤 • 小鼠处理 • 取材 • 收集细胞 • 低渗处理 • 固定 • 制片 • 染色 • 观察

6. 1. 小鼠处理 预处理：实验前2.5-3小时，按每克体重注射2ug ，给小白鼠 腹腔注射秋水仙素。

7. 2. 取 材 颈椎脱臼法处死动物，解剖，剥取股骨，剔去肌肉组织，PS洗涤后剪去两端的股骨头。

8. 3. 收集细胞 冲洗骨髓：吸取1mL低渗溶液,注射器针头插入股骨一端,反复冲洗骨髓到8ml的离心管中，至骨髓发白。

9. 4. 低渗处理 加入6mL0.075MKCl溶液,37℃水浴低渗30分钟，中间（约20分钟）用吸管吹打一次，使细胞分散，悬浮于溶液中. 1000rpm离心8分钟后弃去上清液，离心之前加1ml固定液并用吸管轻轻吹匀，进行预固定。

10. 5. 固 定 沿管壁慢慢加入固定液5ml，用吸管轻轻吹打成细胞悬液后，室温下静置30分钟，15分钟时轻轻吹打一次。 1000rpm离心8分钟，弃上清液。

11. 6. 制 片 用吸管吸取细胞悬液，滴在预冷的载玻片上，在酒精灯火焰上微微加热，室温晾干。

12. 7. 染 色 10% Giemsa染液染色30分钟

13. 8. 观 察

14. 注意事项 A. 细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。 染色体形态和分布良好。 B. 最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。 C. 所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。 D. 在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在,以免影响计数。

15. 作业和思考 • 选择染色体清晰，分散度好的中期分裂相，计数染色体，显微摄影，打印出照片。