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第十七章 转基因技术与作物育种

第十七章 转基因技术与作物育种. 第一节 作物的转基因技术 第二节 转基因作物的遗传特点 第三节 转基因作物品种的选育 第四节 转基因作物的生物安全性. 1. 第十六章 转基因技术与作物育种. 什么是转基因育种 ?. 转基因作物( GMC , genetically modified crops ) 就是根据育种目标,从供体生物中分离目的基因,经 DNA 重组与遗传转化或直接运载进入受体作物,经过筛选获得稳定表达的遗传工程体,并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。. 2. 3. 第五章 转基因技术与作物育种. 转基因育种的优势:

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第十七章 转基因技术与作物育种

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  1. 第十七章 转基因技术与作物育种 第一节 作物的转基因技术 第二节 转基因作物的遗传特点 第三节 转基因作物品种的选育 第四节 转基因作物的生物安全性 1

  2. 第十六章 转基因技术与作物育种 什么是转基因育种? 转基因作物(GMC,genetically modified crops)就是根据育种目标,从供体生物中分离目的基因,经 DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物,经过筛选获得稳定表达的遗传工程体,并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。 2

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  4. 第五章 转基因技术与作物育种 转基因育种的优势: 1.拓宽可利用的基因资源; 2.培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径; 3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择; 4.可以大大提高选择效率,加快育种进程。 此外,还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。 4

  5. 第一节 作物的转基因技术 一、转基因技术的发展现状 1983年美国华盛顿大学宣布成功将卡那霉素抗性基因导入烟草细胞。同年四月,美国威斯康星大学也宣布成功将大豆基因转入向日葵。标志着植物转基因技术的诞生,并对生物工程技术和世界农业都产生了巨大震动。 5

  6. 第一节 作物的转基因技术 世界银行下属机构预测,世界范围内转基因作物产业的交易额: 2005年达到60亿美元; 2010年达到200亿美元, 1500万农民种植转基因作物 种植国家 先后有30多个国家批准了3000多例田间试验,涉及的植物种类有40多种; 2000年有13个国家种植商品化转基因植物; 2004年有17个国家种植商品化转基因植物。 (2004年) 美国(59%),阿根廷(20%),加拿大(6%) 中国(5%),欧洲很少 2004年3月英国批准大面积种植转基因,但要求非常严格。 2005年德国通过法案,严格限制(包括实验室研究)。 6

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  8. 第一节 作物的转基因技术 转基因作物种类:主要为大豆、玉米、棉花和油菜等。 8

  9. 第一节 作物的转基因技术 目标性状:抗除草剂、抗虫和抗病毒病 9

  10. 我国转基因作物研究与利用概况 我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。 1990年,我国自行研制的抗烟草花叶病毒烟草在辽宁省进行了种植,并一度成为世界上最大的转基因植物群落。由于市场的原因现已不推广。 到2006年我国共有1000多例转基因植物申报了安全性评价,批准了近800例,其中,中间试验400多例,环境释放200多例,生产试验100多例,包括转基因水稻、棉花、玉米、油菜、马铃薯、大豆、小麦等30种植物。我国种植面积最大的转基因作物是抗虫棉。 10

  11. 第一节 作物的转基因技术 • 经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有: • 我国自行研制开发的抗虫转基因棉花(转Bt及Bt+CpTI双价抗虫棉)(苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因+胰蛋白酶抑制剂基因) ;2004年种植转基因棉花370万公顷,占棉花种植面积的50% • 美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉;(苏云金杆菌是一类非常重要的昆虫病原体,它能产生特异性的杀虫结晶蛋白) • 延迟成熟期的转基因番茄; • 抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄; • 抗CMV转基因甜椒; • 转查尔酮合酶(CHS)反义RNA基因矮牵牛。 11

  12. 第一节 作物的转基因技术 二、 转基因育种的程序 1、目的基因的获得 2、目的基因重组质粒的构建 3、受体材料的选择和再生系统的建立 4、转基因方法的确定和外源基因的转化 5、转化体的筛选和鉴定 6、转化体的安全性评价和育种利用 12

  13. 二、 转基因育种的程序 基因分离 农杆菌介导 基因枪轰击 体外重组 转化 载体的构建 转化体 筛选 结合常规育种 遗传稳定性评价 转基因品种 安全性评价 市场开发 13

  14. 第一节 作物的转基因技术 (一)目的基因的获得 根据获得基因的途径主要可以分为两大类: 根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆; 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。 分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列 人工合成 1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆 主要步骤如下: 利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。 局限性:兼并密码子、效率低。 14

  15. 设计简并引物 目的基因DNA文库PCR扩增 分离、鉴定扩增产物 再行扩增克隆和功能鉴定 分离目的基因 第一节 作物的转基因技术 2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因 (1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。 15

  16. 得到cDNA阳性克隆 序列和功能分析 获得目的基因 利用标记特异探针进行cDNA文库筛选 第一节 作物的转基因技术 (2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列,通常包含了该基因足够的结构信息区,可以与其它基因相区分。主要是通过cDNA的途径获得。 基本过程 16

  17. 第一节 作物的转基因技术 (3)根据连锁图谱克隆目的基因 图位克隆技术(Map-based cloning) 17

  18. 第一节 作物的转基因技术 cM 1 0.8 Marker a Gene c bp 精细定位 BAC 染色体步移 亚克隆 染色体步移 互补实验 候选基因 cDNA文库筛选 18

  19. 转座子标签法 第一节 作物的转基因技术 (4)转座子标签法转座子是染色体上一段可复制、移动的 DNA片段。当转座子插入到某个功能基因内部时,就会引起该基因的失活,并诱导产生突变型;当转座子再次转座或切离这一位点时,失活基因的功能又可得到恢复。 目前应用最为广泛的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。 19

  20. (5)差异显示法 在生物个体发育不同阶段,或不同的组织与细胞中或不同环境下,基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式,叫做基因的差异表达。差异显示PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳,并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。该条带可能是全长或是部分特异表达的基因,利用这种方法进行基因克隆的方式就是差异显示法基因克隆。 叶 根 随机引物+3’锚定poly(t)引物 叶mRNA 反转录 PCR PAGE 根mRNA 反转录 PCR 20

  21. (二)目的基因重组质粒的构建 目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中 包括保存用中间载体(大肠杆菌寄主):pBR322、pUC、 pBluescript K、pKS,pGEM-T 繁殖载体(大肠杆菌寄主): JM109, TOP10 植物转化载体(农杆菌寄主): pBI121, pCAM1001 质粒是一种环状双链的DNA分子.自身在细菌细胞中能不断复制繁殖,质粒DNA能从细菌中提出来,又能再转入细菌,这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制,这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件,即将一种外源基因与质粒重组后,再转入细菌中去复制繁殖,使外源基因得以增殖。 21

  22. 第一节 作物的转基因技术 分离基因 克隆到某中间载体 pKS,pBR332,pGEM-T 转化大肠杆菌 JM109, TOP10… 提取质粒 限制酶切/连接 HindIII/EcroI… T4 ligase 克隆到植物表达载体 pBI121, pCAM1001… 转化农杆菌 基因枪转化 22 LBA4404, EHA

  23. Ti质粒双元转化载体结构 示意图 Ti质粒共合转化载体结构 示意图 双元载体系统:binary Ti vector system 23

  24. 第一节 作物的转基因技术 (三〕受体材料的选择 受体是指用于接受外源DNA的转化材料。 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件: 1、高效稳定的再生能力; 2、受体材料要有较高的遗传稳定性; 3、外植体来源稳定、方便,如胚和其它器官等; 4、对筛选剂敏感; 5、转化率高 受体材料系统存在的主要问题:再生率低,基因型依赖性强,再生细胞部位与转化部位不一致等。 24

  25. 第一节 作物的转基因技术 常用的受体材料有以下几大类型: 1.愈伤组织再生系统 外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织,转化(带有目的基因质粒的农杆菌侵染),分化培养获得再生植株。 优点:外植体来源广,繁殖快,易接受外源基因, 转化效率高。 缺点:转化的外源基因遗传稳定性差,容易出现嵌合体。 25

  26. 2.直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段,而是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点:周期短、操作简单,体细胞变异小,遗传稳定; 缺点:禾谷类作物进行茎尖培养相对困难,转化率低。 3.原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力,是应用最早的再生受体系统之一。 优点:高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质,获得基因型一致的克隆细胞,所获转基因植株嵌合体少,适用于多种转化系统; 缺点:不易制备、再生困难和变异程度高。 26

  27. 第一节 作物的转基因技术 4.胚状体再生系统 优点:个体数目巨大、同质性好,接受外源基因能力强, 嵌合体少,易于培养、再生。 缺点:技术含量高,多数植物(禾本科)不易获得胚状体。 5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统; 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化,如花粉管导入法,花粉粒浸泡法,子房微针注射法等。 27

  28. 第一节 作物的转基因技术 (四)转基因方法 概括起来说主要有两类: 第一类是以载体为媒介的遗传转化,也称为间接转移系统法。 第二类是外源目的DNA的直接转化。 28

  29. 第一节 作物的转基因技术 1.载体介导转移系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统,通过载体将携带的外源基因导入植物细胞,整合在核染色体组中并随核染色体一起复制和表达。 农杆菌Ti质粒或 Ri质粒介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 包括:叶盘法、真空渗入法和原生质体共培养法。 29

  30. 第一节 作物的转基因技术 (1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。 农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 叶盘转化法 分化生芽 生根 30

  31. 第一节 作物的转基因技术 (2)真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中,经真空处理,造伤,使农杆菌通过伤口感染植株,在农杆菌的介导下,发生遗传转化。 简便、快速、不需要组织培养,但转化效率不高。 (3)原生质体共培养 分离、纯化 电融合 融合过程 愈伤组织 组织分化 31

  32. 第一节 作物的转基因技术 2.外源基因直接导入法 (1)化学刺激法 细胞融合剂:聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVC)可以刺激原生质体吸收DNA片段。 (2)基因枪轰击法(微弹轰击技术) 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面,借助高压动力射入受体细胞或组织,最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行:适合于大多数细胞或组织,克服了受体材料的限制,不必制备原生质体,具有相当广泛的应用范围,已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 到目前为止,利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。 32

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  34. 第一节 作物的转基因技术 (3)电穿孔法:将受体细胞置于脉冲电场中,可以使细胞膜产生短暂的(Ø30nm)左右的微孔,吸收DNA片段。 (4)微注射法 细胞操作: 利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞(原生质体或生殖细胞)固定,然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。 子房注射法或花粉管通道法: 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。 34

  35. 第一节 作物的转基因技术 (五)转化体的筛选和鉴定 1.转化体的筛选 外源目的基因转化频率低,目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少,使用特异性选择标记基因进行标记,有效地选择出真正转化细胞。 常用选择标记基因:抗生素抗性基因、除草剂抗性基因; 将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因,克隆到质粒载体上,与目的基因同时进行转化。 标记基因在受体细胞表达,使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。 35

  36. 第一节 作物的转基因技术 2.转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达,还必须对抗性植株进一步检测。 • DNA水平的鉴定 • 检测内容:是否整合、拷贝数、整合位置。 • 检测方法:特异性PCR(以外源基因两侧序列设计引物) • Southern杂交(外源目的基因序列为探针) 36

  37. 第一节 作物的转基因技术 37

  38. 第一节 作物的转基因技术 (2) 转录水平的鉴定:外源基因转录形成mRNA 常用的方法 Northern杂交(标记的RNA为探针对总RNA杂交) RT-PCR 检测 mRNA cDNA PCR 38

  39. 第一节 作物的转基因技术 (3)翻译水平的鉴定 为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译,还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。 主要方法:Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。 39

  40. 第一节 作物的转基因技术 (六)转化体的安全性评价和育种利用 根据有关转基因产品的管理规定、在可控制的条件下进行安全性评价和大田育种利用研究。 理论上潜在的危险: ( 1 )转基因载体:选择标记和载体其他的构件 ( 2 )转基因代谢产物: “ 一因多效 ” ,主产物和次生物( 3 ) “目的 ” 基因的转移 通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种(系)原因:外源基因失活、纯合致死、花粉致死、其它性状变化等。因此获得转化体后,应结合杂交、回交、自交等常规转育手段,最终选育综合性状优良的转基因品种。 40

  41. 第二节 转基因作物的遗传特点 少数外源基因整合到植株能稳定遗传,正常表达,符合孟德尔遗传。 大多失活或表现复杂的遗传方式。 原因:外源基因受宿主基因组排斥而发生片段丢失、重排; 多拷贝;整合随机性; 一、整合机制 1、同源重组:外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列间发生交换替代,并整合到受体染色体组上的一种重组方式。 2、位点特异性重组:在两条DNA特异位点上,通过位点特异性重组酶的作用,对DNA的特异性切割实现外源基因的整合。 3、转座作用 4、异常重组 41

  42. 第二节 转基因作物的遗传特点 二、整合后外源基因表现 整合进入植物基因组的外源基因中只有很少一部分整合到基因组,能稳定遗传的外源基因所占比例非常小。利用转化效率较高的农杆菌对模式植物拟南芥进行外源基因转移来看,外源基因整合进入基因组的平均比例为30%-80%,而能够稳定遗传的转基因植株所占百分比例一般不超过10%。 不表达 1、基因丢失 2、基因沉默:指整合到基因组中的外源基因不能正常表达,而是处于一种失活状态。 表达 1、符合孟德尔遗传;2、独立转化体之间差异;3、无规律。 42

  43. 第三节 转基因作物品种的选育 通过转基因技术获得的转化植株很少直接作为品种进行推广应用。 将外源基因导入受体植株只能赋予该株具有特定的目标性状,对于其他目标性状是否符合生产的需要还不清楚。 外源基因的插入很有可能对原有基因组的结构发生破坏,并对宿主基因的表达产生影响,这势必影响甚至改变该作物品种的原有性状。 此外,转基因植物的安全风险性也是一个值得考虑的问题。 因此通过转基因方式获得的植株还必须通过常规的品种鉴定途径才能用于生产。从现有转基因育种情况来看,所获得的转基因植物主要用于为培育新的作物品种而创造育种资源。 43

  44. 第三节 转基因作物品种的选育 一、转基因作物育种目标的制定 二、转基因方法的确定及转基因植株的获得 三、转基因作物品种的选育 • 纯系育种 • 回交育种 • 杂交育种 • 杂交种 44

  45. 第四节 转基因作物的生物安全性 45

  46. 第四节 转基因作物的生物安全性 直至今天,转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论。 反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险,可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。 在欧洲,转基因作物被一些媒体称之为“恶魔食品”(frankenstein food)。 Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造、最终又毁灭了这个科学家的怪物。那么,人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己,还是拯救自己呢? 46

  47. 第四节 转基因作物的生物安全性 对转基因作物的安全性争论,国际上有几个典型的事件。 Pusztai事件: 英国Rowett研究所有位Pusztai博士,他用转雪莲花凝集素基因的土豆喂大鼠,1998年秋天在英国电视台发表讲话,声称大鼠食用了这种土豆后,体重和器官重量减轻,免疫系统受到了破坏。 后果:绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”,并策划了破坏转基因作物试验地等行动,焚烧了印度的两块试验田,甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏,以致研究生毕业论文都无法如期完成。 英国皇家学会组织了同行评审,并于1999年5月发表评论,指出Pusztai的试验有六方面的错误:不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异;对食用转基因土豆的大鼠,未补充蛋白质以防止饥饿;供试动物数量少,饲喂几种不同的食物,且都不是大鼠的标准食物,缺少统计学意义;试验设计差;统计方法不当;试验结果无一致性等。 47

  48. 第四节 转基因作物的生物安全性 斑蝶事件:1999年5月,康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志上发表文章,声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上,用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶,导致44%的幼虫死亡。 这一实验结果在科学上没有说服力:玉米的花粉非常重,扩散不远,在玉米地以外5米,马利筋叶片/CM2上只找到一个玉米花粉;2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明,抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁,实验室试验中用10倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫,也没有发现对其生长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因,一是农药的过度使用,二是墨西哥生态环境的破坏。 48

  49. 第四节 转基因作物的生物安全性 加拿大“超级杂草”事件: 由于基因漂流,在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂,因而有人称此为“超级杂草”,并怪罪于转基因。 基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流,就不会有进化,世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。举例来说,小麦由A、B、D三个基因组组成,它是由分别带有A、B、D基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以,以此来禁止转基因作物,也是没有道理的。 49

  50. 第四节 转基因作物的生物安全性 中国Bt抗虫棉破坏环境事件: 2002年6月3日,南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议,6月4日《China daily》上发表了题为“GM Cotton Damage Enviroment”的文章。 当天,绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告,从而再次引发国际争论,在欧、美产生巨大反响。 6月5日德国《农业报》发表了题为 “中国研究:Bt棉破坏环境巨大”。 绿色和平组织的“中国项目主管”声称:“棉农将面对不受控制的超级害虫”、 “转基因抗虫棉不但没有解决问题,反而制造了更多的问题”、“棉农将被迫使用更多、更毒的农药”。 事实上,抗虫棉在中国实践多年,深受广大棉农的欢迎。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论,反驳绿色和平组织的观点。 50

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