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Tema 10: Clonación y secuenciación del DNA

Tema 10: Clonación y secuenciación del DNA. Objetivos tema 10: Clonación y secuenciación del DNA. Deberán quedar bien claros los siguientes puntos: ¿Cómo se manipula el DNA? Las endonucleasas (enzimas) de restricción

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Tema 10: Clonación y secuenciación del DNA

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  1. Tema 10: Clonación y secuenciación del DNA Clonación y secuenciación del DNA

  2. Objetivos tema 10: Clonación y secuenciación del DNA • Deberán quedar bien claros los siguientes puntos: • ¿Cómo se manipula el DNA? • Las endonucleasas (enzimas) de restricción • Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores • Vectores eucarióticos • Organismos transgénicos • Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto • Mapas de restricción • Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción • La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • La secuenciación del DNA Clonación y secuenciación del DNA

  3. Manipulación del DNA Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias. Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico Esta tecnología se denomina: Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica • Propiedad básica del DNA que permite su manipulación: • El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado Clonación y secuenciación del DNA

  4. Herramienta básica 5´-GGATCC- 3´ 3´-CCTAGG- 5´ • Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato. • Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) • Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes Clonación y secuenciación del DNA

  5. Dos tipos de cortes: • Corte plano: • extremos romos • Corte escalonado: • extremos pegajosos o cohesivos EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens Clonación y secuenciación del DNA

  6. Herramienta básica • Las enzimas de restricción tipo II: • Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos Clonación y secuenciación del DNA

  7. Vector híbrido Clonación del DNA • DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) • Vector de clonación (vehículo) • Organismo huésped (E. Coli) • Selección de vectores Clonación y secuenciación del DNA

  8. Clonación del DNA Vectores híbridos (quimera) Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción. Ligasa sella zona híbrida • Vectores de clonación • Plásmido (1 sitio de corte) 2-15 kb • Fago  (Lambda) • Cósmido Clonación y secuenciación del DNA

  9. Clonación del DNA Fago  • Vectores de clonación • Fago  (2 sitios de corte) < 24 kb • Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb Clonación y secuenciación del DNA

  10. Clonación del DNA • Vectores de clonación • Cósmido: extremos cos  + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb • BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas Cósmido Clonación y secuenciación del DNA

  11. Clonación del DNA • Huésped: E. coli • Inserción del vector híbrido en el huésped: • Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma • Fago  (transducción, inserción en DNA huésped) • Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido) Clonación y secuenciación del DNA

  12. Selección de vectores híbridos • Plásmido: resistencia a antibióticos • Fago  : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de  si contiene el inserto foráneo) Clonación del DNA Clonación y secuenciación del DNA

  13. Obtención de la secuencia que se clona • Un gen • Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias) • Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp • Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun) • Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo Clonación del DNA Clonación y secuenciación del DNA

  14. Vectores eucarióticos Resistencia a antibiótico (p.e., ampr) Origen de replicación del DNA de levadura (ARS) Región centromérica (CEN) Origen de replicación bacteriano (ori) Telómero ori ampr CEN ARS Telómero • Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas • Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): • Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura) • Puede incorporar más de 500 kb de DNA Linealización (con endonucleasas) y adición de extremos teloméricos Clonación y secuenciación del DNA

  15. Transfección: • Introducción de DNA foráneo en eucariotas • Organismo transgénico: un eucariota con DNA foráneo • Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con fosfato cálcico (poco eficiente) • Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgénicos 15% eficiencia) Métodos transfección Clonación y secuenciación del DNA

  16. Métodos transfección • Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección viral) Clonación y secuenciación del DNA

  17. Métodos transfección • Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA • Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial) • Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA • Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y elementos móviles (Elemento P en Drosophila) Clonación y secuenciación del DNA

  18. Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos Población de fragmentos Clonación y secuenciación del DNA

  19. Separación fragmentos Reptación de los fragmentos a través del gel de agarosa Clonación y secuenciación del DNA

  20. DNA teñido con bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV Clonación y secuenciación del DNA

  21. Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos • Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda • Transferencia en Southern (Southern blotting) • Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA Clonación y secuenciación del DNA

  22. Transferencia en Southern (esquema resumen) Clonación y secuenciación del DNA

  23. Mapas de restricción mediante enzimas de restricción Clonación y secuenciación del DNA

  24. Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Clonación y secuenciación del DNA

  25. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Clonación y secuenciación del DNA

  26. Clonación y secuenciación del DNA

  27. Clonación y secuenciación del DNA

  28. Usos de la PCR • Secuenciación • DNA fósil (evolución, arqueología, historia) DNA traza • Fósiles • Mamut lanudo (40000 años) • Abraham Lincoln (síndrome de Marfan, afecta tejido conectivo, fribrilina) • Hombre Neandertal -> Hablaba como nosotros? Color cabello? • Huellas dactilares del DNA (DNA forense) Clonación y secuenciación del DNA

  29. Secuenciación de DNA Disoxi Didesoxi La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen. • La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse • Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes • La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular • Secuenciación de genomas: estructura del genoma • Métodos: • Secuenciación manual (inicial) • Químico (Maxam y Gilbert 1977) • Didesoxi (Sanger 1977) • Secuenciación automatizada (1986,…) Clonación y secuenciación del DNA

  30. Secuenciación del DNA Clonación y secuenciación del DNA

  31. Secuenciación automatizada del DNA Clonación y secuenciación del DNA

  32. Clonación y secuenciación del DNA

  33. Clonación y secuenciación del DNA

  34. Clonación y secuenciación del DNA

  35. Clonación y secuenciación del DNA

  36. Animaciones de técnicas de la genética http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html Clonación y secuenciación del DNA

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