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男性不育的实验室诊断及评估

男性不育的实验室诊断及评估. 南京医科大学生殖医学重点实验室 周作民. 维持男性生育的基本条件： （ 1 ）睾丸内产生足够数量的精子。 （ 2 ）精子在男性生殖管道内获得运动能力和 受精能力，既精子的成熟。 （ 3 ）输精管道通畅。 （ 4 ）具有正常的性功能。 （ 5 ）附属性腺功能正常。. 不育症诊断的步骤： 1.  病史采集 : 包括年龄、职业、生育史、疾 病史、家族史等。 2.   体格检查：包括外生殖器和全身体检。 3.   实验室诊断 4.   特殊检查. 一、 精液常规分析 　　　　┌ 精子 （ 5% ）

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男性不育的实验室诊断及评估

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Presentation Transcript

  1. 男性不育的实验室诊断及评估 南京医科大学生殖医学重点实验室 周作民

  2. 维持男性生育的基本条件： （1）睾丸内产生足够数量的精子。 （2）精子在男性生殖管道内获得运动能力和 受精能力，既精子的成熟。 （3）输精管道通畅。 （4）具有正常的性功能。 （5）附属性腺功能正常。

  3. 不育症诊断的步骤： 1. 病史采集: 包括年龄、职业、生育史、疾 病史、家族史等。 2.  体格检查：包括外生殖器和全身体检。 3.  实验室诊断 4.  特殊检查

  4. 一、 精液常规分析 　　　　┌精子（5%） 精液组成┤　　　　　 ┌精囊腺液（60%）－凝固因子、果糖 　　　　└精浆（95%）├前列腺液（20%）－液化因子 　　　　　　　　　　 ├尿道球腺液（3%） 　　　　　　　　　　　└睾丸液、附睾液 ——精子

  5. 精液分段成分： 前段－睾丸液，附睾液（精子），尿 道球腺液 中段－前列腺液 后段－精囊腺液

  6. 精液变量的参考值： 精液量：2～6ml颜色：灰白 液化时间：<60分 粘稠度：拉丝<2cm pH： 7.2～8.0 活率：>60% 活力： A+B>50%或A>25% 精子计数：>2000万/ml 畸形率：<30% 脓细胞： < 5个/HP （<1×106/ml)

  7. 精子活力分级 A 级：快速前向运动 B 级：慢或呆滞的前向运动 C 级：非前向运动 D 级：不动

  8. 影响精液常规数据准确性的因素： ①自身的波动性: 要求首次检查应连续进行两次,间隔时间7 天—3周，两次结果差异大时应再检一次。

  9. 每周测定一次精子密度，连续120周，期间此人未服药，也无发热，结果显示精子密度可有显著性波动。每周测定一次精子密度，连续120周，期间此人未服药，也无发热，结果显示精子密度可有显著性波动。

  10. ② 禁欲时间：　要求2－７天 ③采精方式：　要求用手淫法或取精器取精。 ④盛精容器：　要求用对精子无毒性的玻璃或塑料容器。 ⑤室温： 要求不低于20度 ⑥观察时间： 要求精液液化后，取精后1小时内检测。　 ⑦检测设备： 冬天检测应注意保温。

  11. 精液常规异常的分析： 1.精液量异常 1)无精液症：精液量<0.5ml或无 病因：①性交不射精 　　　②逆行射精 2)少精液症：精液量为0.5～2ml 病因：①性交频率过高　②附属性腺先天性发育不良 　　　③附属性腺感染　④雄激素水平下降　⑤年龄因素 3)多精液症：精液量>6ml 病因：①附属性腺感染　②附属性腺功能亢进

  12. 2.精液液化及粘稠度异常 ①精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流动性大。 　 病因：精囊腺炎症 ②精液不液化或液化不全：液化时间>30分 病因：前列腺功能障碍

  13. 3.精液pH异常： 测量方法：pH试纸(pH范围6.1-10.0 或6.4-8.0) ①pH过低：pH<7.2 原因：①输精管和精囊腺的缺如　 ②附睾病变 ② pH过高： 原因：①精囊腺液分泌过多　 ②前列腺液分泌过少

  14. 4.精子记数异常： 正常≥20×106个/ml 测定方法：①血球计数板　②一次性精子计数板 　　　　 　③Makler精子计数板　④CASA仪 1)少精子症：<20×106个/ml 严重少精子症：<5×106个/ml 2)无精子症：精液须经离心，沉淀物中仍未见精子者，并须 连续检查三次尚可确诊。 3)多精子症：>250×106个/ml

  15. 5.精子畸形： 观察方法：①吉姆萨染色法或瑞士染色法 　　　　　②巴氏染色法 　　　　　③布赖恩－利什曼染色 　　　　　④肖尔染色法 畸形分类：①头部畸形：大头，小头，锥形头，梨形头， 无定形头，空泡样头，双头等。 　　　　　②颈和中段畸形：缺尾，弯曲尾，肿胀，过薄等。 　　　　　③尾部畸形：短尾，多尾，断尾，卷尾，双尾等 　　　　　④胞质残余体：常位于精子颈部

  16. ６．白细胞检查： ①正甲苯胺蓝过氧化酶染色法： 　结果：白细胞染成棕红色 ②联苯胺法：染料：联苯胺＋玫瑰红 　结果：白细胞－褐色；其它细胞－品红色。

  17. 二．精子运动特性的检测和分析 1.显微镜观察： 注意事项： (1)取精液10 ul，滴于玻片，盖上22×22盖玻片，静置1 分钟后观察。 (2) 控制温度，最好在37℃进行 (3) 每次观察4～6个视野，计算100个细胞，计算A级、 B级、C级和D级精子的百分比，连续观察两张滴片， 误差不得>10%。

  18. 2.多点曝光技术：在1秒钟内对精子连续曝光6次，可判断精子的运动速度及运动轨迹。2.多点曝光技术：在1秒钟内对精子连续曝光6次，可判断精子的运动速度及运动轨迹。 精子运动速度分布： 快速： ≥ 25微米/秒 中速： 10—25微米/秒 慢速：<10 微米/秒

  19. 3.计算机辅助的精子分析系统（CASA） 原理：用高分辨率摄像机实时记录精子及精子运动图象， 用分析软件对图象进行处理和分析，并得出结果。 硬件：显微镜，摄像机，微机 软件：图象分析系统

  20. 参数及意义： 1)运动精子密度：①活动率　②前向运动率 2)活力参数：①平均路径速度 　　　　　 ②曲线速度 　　　　　 ③直线速度

  21. 不足之处： ①价格高 ②误判多：特别是脱落细胞多时 ③不能识别畸形精子、脓细胞 ④ 对待检标本的精子密度有一定要求：精子数量少时， 计数偏高，精子数量高时，活率偏高。

  22. ４．宫颈粘液穿透试验： 1)体内试验：性交后试验（PCT） 注意事项：①排卵期进行 　 　　　　②禁欲至少2天 　　 　　　③最好在性交后9～24小时进行观察。 诊断标准：正常为宫颈粘液中的活动精子数>50个/HP或 A级精子>20个／HP

  23. 影响因素：①女方的内分泌状况。 　　　　　②宫颈粘液中的白细胞。 　　　　　③阴道pH，<7或>8.5可导致PCT异常。 ④宫颈结构异常。 ⑤抗精子抗体影响。 ⑥性功能异常,如阴道痉挛。 　　　　　⑦精子质量差。

  24. 2)体外试验： ①玻片试验 ②精子－宫颈粘液接触试验 ③毛细管试验: 穿透介质: 人宫颈粘液; 宫颈粘液代用品: 牛宫颈粘液; 含人血清精子营养液; 含牛血清白蛋白精子营养液; 鲜鸡蛋清;

  25. ５．精子顶体酶测定（明胶膜法）： 1)制备5%明胶溶液，吸取100ul均匀涂于载玻片上，自然干燥，4℃湿盒备用，使用前用甲醛－酒精固定液固定60分钟。 2)精子处理：取液化精液，用PBS稀释至2～4×106个/ml。 3)涂片：取1滴精液涂于明胶膜上，37℃湿盒2小时。 4)观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精子的平均反应直径。 5)正常值：平均反应率≥65%，平均反应直径≥25μm。

  26. 6．去透明带仓鼠卵穿透试验 1)精子准备： ①精液充分液化 ②调整精子浓度至10×106个/ml ③精子获能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空气中， 37℃孵育18～24小时，调整精子浓度至4×106/ml。

  27. 2)卵细胞准备： ①取动情第一天仓鼠，腹腔内注射PMSG 30～40U，48～72 小时后再次注射HCG 30～40U，18小时后输卵管内取卵。 ②1%透明质酸去除卵丘细胞，0.1%胰蛋白酶去除透明带。 3)体外受精： 　　将0.1ml精液加至液体石蜡下，再加入20～30个仓鼠卵，培养3小时。 4)结果观察： 相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算受精率，正常为≥10%。

  28. 三．精液生化指标检测 1.酸性磷酸酶测定（ACP） 原理：P－硝基酚磷酸二钠ACP→P－硝基酚 测定产生的P－硝基酚含量，推测ACP的活性 正常值：≥200U／一次射精 意义：反映前列腺功能

  29. 2.果糖测定：间苯二酚法 原理：果糖＋间苯二酚　加热　→　红色化合物 测定化合物含量 正常值：0.87～3.95g/L 意义：反映精囊腺功能与精子供能有关 3.α－糖苷酶测定 原理：麦芽糖α－糖苷酶　→葡萄糖 测定葡萄糖含量 正常值：35.1～87.7U/ml 意义：反映附睾功能

  30. 四．抗精子抗体测定 1.常用方法： 1)凝集试验： 原理：大分子或多价抗体如IgM或分泌型IgA可以在精子间形成交链，产生精子凝集，观察。 ①试管－玻片凝集试验（FramRlin-Dukes）： 　　将待检样本与液化的精液混合后，于３７℃孵育１小时，显微镜下观察，出现３条以上精子头－头、尾－尾或头－尾连接即为凝集，观察１０个视野，５个以上出现凝集即为阳性。 ②圆盘凝集试验（Friberg） ③凝胶凝集试验（Kibrick） 缺点：假阳性高

  31. 2)精子制动试验（Isojima）： 原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制精子的运动能力。 缺点：敏感性差，IgA的作用常测不出，吸附于精子头部的AsAb作用也常常测不出。

  32. 3)直接免疫荧光试验： 原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后，如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现荧光。 优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假阳性多。 4)免疫珠试验： 原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比，且可确定吸附部位。 优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较贵。

  33. 5）混合抗球蛋白抗体试验（MAR试验）： 原理：将精液与包被了IgG或IgA的乳胶颗粒或红细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成混合凝集预示精子表面存在IgG或IgA.

  34. 6)酶联免疫吸附试验（ELISA）： 原理：将精子抗原吸附于酶标板上，加入待检样本，如有AsAb则吸附于精子抗原上，加入酶标二抗，与AsAb结合，最后加入底物，产生颜色反应。 优缺点：可大规模使用，但有假阳性和假阴性，必须设定阳、阴性对照。

  35. 五．激素测定 六．遗传检测 （一）染色体检查 １．染色体的非整倍体 １）性染色体的非整倍体 　　精子发生需要性染色体的平衡，即一个X和一个Y，X或Y的数目异常均可导致精子发生异常。

  36. (1) 47,XXY男性（Klinefelter’s syndrome），发生率1：500，睾丸发育不良，精子发生障碍；46,XY/47,XXY亦经常发生，伴有无精子或少精子。 (2) 48,XXXY，49,XXXXY表型为女性，阴茎发育不良，隐睾。 (3) 46,XX男性：由于Y染色体的短臂（Yp11）异位到X染色体的短臂上（Xp22）。内生殖器表现型取决于Yp11的断裂部位，Yp11远端（SRY附近）的断裂常导致隐睾、小阴茎、尿道下裂。 (4) 45,X男性，较少见，为Y长臂缺失，短臂异位至常染色体上（13,15,22常见）。 (5) 47,XYY发生率1：750，活检显示曲精小管受损，生精阻滞于精母细胞阶段，有时有精子生成。少数人能生育，但胚胎易死亡，或后代有异常染色体，45－75%精母细胞带有二个Y。 (6) Y－A平衡异位：Y长臂远端的异染区（Yq12）转移至端着丝粒常染色体的长臂上，Y长臂断裂在Yq11上，断裂部位对精子发生的影响较大，距Yq11较近时，精子发生基因受损，致精子发生障碍。断裂距Yq11较远时，精子发生可正常并能生育，但带有Y－A异位的很易再断裂而引起不育，或将异位传给子代，使子代发生断裂而导致精子生成障碍。

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