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植物 DNA 提取

植物 DNA 提取. DNA 是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的 DNA 是非常重要的前提。. DNA 提取原则. 保证 DNA 结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染. 染色体 DNA 提取的几种方法. CTAB 法 SDS 法. 一、实验目的： 掌握 CTAB 法提取植物 DNA 的原理和方法. 二、 CTAB 法的原理.

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植物 DNA 提取

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Presentation Transcript

  1. 植物DNA提取

  2. DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。

  3. DNA提取原则 • 保证DNA结构的完整性 • 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 • 排除有机溶剂和金属离子的污染 • 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 • 排除其他核酸分子的污染

  4. 染色体DNA提取的几种方法 CTAB法 SDS法

  5. 一、实验目的： • 掌握CTAB法提取植物DNA的原理和方法

  6. 二、CTAB法的原理 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

  7. 三、实验材料、器具及药品 • 实验材料：新鲜油菜 • 实验器具：　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，水浴锅，摇床。 • 实验药品：CTAB缓冲液，异丙醇，TE，氯仿，异戊醇，乙醇。

  8. CTAB缓冲液中各个组分的作用 • Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； • EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性； • NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； • CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

  9. β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 • PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

  10. 除蛋白质： • 氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程 中出现的气泡）。 • 使用变性剂变性 （SDS、异硫氰酸胍等） • 高盐洗涤 • 蛋白酶处理

  11. 除多糖： • 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 • 用多糖水解酶将多糖降解。 • 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。

  12. 除酚类物质： • 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 • 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合

  13. 除盐离子： 70％的乙醇洗涤

  14. TE中成分的作用 • TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase • pH值为8.0，可防止DNA发生酸解

  15. 四、实验流程

  16. 裂解液 异丙醇沉淀 植物材料 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 CTAB法流程图

  17. 称取样品2g，液氮研磨，加入预热的(65℃) CTAB30ml及β-巯基乙醇 保温0.5h,期间不停的摇均 吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min 取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃/-20 ℃保温沉淀 10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存

  18. 基因组DNA的检测 • 高质量的基因组DNA带型 单一，无拖尾现象 • DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL • 双链 DNA， A260/280 约为1.8

  19. 五、注意的问题 材料准备： 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。 液氮研磨： 研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。 细胞裂解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。高温温浴时，定时轻柔振荡。

  20. DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙 醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀，且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。 DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。 DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。

  21. 附：DNA提取常见问题及解决方法 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 • 重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质 • 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 • 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） • 加入RNase降解RNA • DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 • DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 • DNA中残留有金属离子 • 有RNA的存留 对 策

  22. 问题二：DNA降解。 原 因 • 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 • 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 • 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 • 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 • 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 • 材料不新鲜或反复冻融 • 未很好抑制内源核酸酶的活性 • 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 • 外源核酸酶污染 • 反复冻融 对 策

  23. 问题三：DNA提取量少。 原 因 • 实验材料不佳或量少 • 破壁或裂解不充分 • 吸附或沉淀不完全 • 洗涤时DNA丢失 • 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 • 植物要匀浆研磨充分 • 增加吸附的时间，或低温沉淀 • 小心操作 对 策

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