Elektroforézis

1. Elektroforézis • Általában agaróz a hordozó • Különleges tisztaság, kis elektrendoozmózis • DNS festése a DNS-hez kötődő fluoreszcens festékkel • Ethidium bromide a leggyakoribb • carcinogen • Újabban a Syber green nagyon népszerű • Sokkal érzékenyebb • Nem carcinogen

2. Agaróz gél Mi ez a fragmentum itt? DNS felvitel helye Vándorlás Pozitív Negatív Kis fragmen -tumok Ezen a végén fényesebbek a fragmentumok. Miért?

3. Southern Blot

4. Pulsed Field Gel elektroforézis • A hagyományos gélelfo nem jó a nagy DNS fragmentumok elválasztására • Még a nagyon híg géleknél is a 40 kb-nál nagyobb fragmentumok a zsebben maradnak • Kromoszóma méretű DNS-ek nem izolálhatók • Alternatíva a Pulzáló Terű Gélelektroforézis • Az áram irányát 90 fokkal változtatjuk időnként • A kisebb molekulák gyorsabban veszik fel az irányt és gyorsabban mozognak a gélben

5. Minta PFG

6. DNS szekvenálás • Sanger didezoxi láncterminációs módszere

7. Sanger gél Nagy fragmentumok Mekkora lehetséges legkisebb fragmentum mérete? Kis fragmentumok

8. Maxam Gilbert szekvenálás • A bázisok közötti kötés kémiai bontása specifikusan (C, G, az összes purin, az összes pirimidin) • A reakciót nem hagyjuk teljesen végigmenni • Az egyik véget radioaktívan jelöljük • A radioaktív fragmentumok mindig a jelzett véggel kezdődnek, a fragmentumok hossza véletlenszerű • A fragmentum utolsó bázisát a kémiai tulajdonsága határozza meg

9. Maxam-Gilbert gél C T A G

10. A footprint módosított Maxam-Gilbert gél • Egy általános nukleázt használunk. • Véletlen hosszúságú fragmentumokat készít • Az eredeti DNS molekula végét jelöljük terminális transzferázzal • Ha a nukleáz kezelés előtt valami kötődött a DNS-hez, az enzim a lefedett DNS-t nem tudja hasítani • Néhány sáv hiányozni fog • A hiányzó sávok jelzik, hogy hol volt beborítva DNS

11. Footprint Kötő hely. Ha Párhuzamosan egy szekvenáló reakciót is futtatunk, akkor pontosan meg tudjuk mondani a fehérje kötőhelyének szekvenciáját.

12. Mutáció a baktériumokban • Darwin vs. Lamarck • Olyan egyszerűek a batériumok, hogy lamarckiánusok? • Nem • Szélesztés lemezre (Newcombe) Antibiotikum nélkül, Antibiotikummal, Mutánsok már korábban ott voltak a tenyészetben

13. Replica Plating Friss lemez Ha nincs antibiotikum, akkor konfluens növekedés Antibiotikum jelenlétében • Joshua és Esther Lederberg • Nyomdázás bársonnyal Minden telep egy már korábbi mutációt jelez.

14. Fluktuációs teszt • Luria és Delbrück • Statisztikus variáció a mintákban • Egy éjszakás tenyészettel indul • Mintákat vesz és széleszti fág rezisztenciára • Egy mintasor ugyanabból a tenyészetből • Más mintasorok különböző csövekből • Széleszti, minden lemez egy egyedi o.n. tenyészetből Eltérő telepszám, fluktuáció.

15. Vezérelt evolúcióDirected Evolution • Megkérdőjelezi Luria és Delbrück elveit • Azt mondja, hogy a mutáció szelekció után következik be • A jelenség számos organizmusnál megfigyelhető • A tipikus kísérletnél éheztetik a sejteket egy szükséges tápanyagra és azt figyelik, hogy az új mutációk mikor és milyen gyakorisággal jelennek meg

16. Directed Evolution Kettős mutánst sokkal nehezebb megkapni, mint az egyszerest.

17. Directed Evolution mechanizmusok

18. Hipermutabilitás • Loewe et. al. (2003) • Adatok több mint 10,000 generációból • Mutációk/genom/nap

19. Roth módosította a hipotézist • AdinBgén,ami a DNS polimeráz IV-et kódolja, szorosan kapcsolt a lac-hoz • Ha a lac amplifikálódik, akkor adinBis • A DinBegy hibázó(error prone)enzim, ezért a mutációs ráta is nő.