slide1 l.
Download
Skip this Video
Download Presentation
Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Jul

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 41

Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Jul - PowerPoint PPT Presentation


  • 345 Views
  • Uploaded on

Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie De Smet Mr. Wim Goeteyn Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse. Overzicht. Doel Algemene richtlijnen Technieken Uit te voeren proeven. Doel.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Jul' - pembroke


Download Now An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Praktische Oefeningen

  • MEDISCHE BIOCHEMIE
  • Prof. Dr. J. Van Bocxlaer
      • Apr. Ruben t’ Kindt
      • Apr. Michael Storme
      • Apr. Julie De Smet
      • Mr. Wim Goeteyn
      • Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse
slide2

Overzicht

  • Doel
  • Algemene richtlijnen
  • Technieken
  • Uit te voeren proeven
slide3

Doel

  • = bepaling van endogene componenten in een
  • biologische matrix...
  • Bloed Urine Punctievocht Etc.
  • Serum / Plasma
  • Complicatie:vele andere, gelijkaardige componenten aanwezig dikwijls in veel  conc.
  •  nood aanSELECTIVITEIT
  • SENSITIVITEIT
  • …om pathologische toestandenop te sporen en/of te bevestigen
slide4

Afname zonder

  • anticoagulans
  • STOLLING
  • Afname met
  • anticoagulans
  • GEEN STOLLING

uitzakking of centrifugatie

SERUM: helder

supernatans

PLASMA

Prop: cellulair materiaal

stollingsEW

RBC, WBC

  • Bloed
slide5

Anticoagulans

  • = antistollingsmiddel
  • wordt toegevoegd aan proefbuis voor bloedafname

Voorbeelden:

NaF

NaCitraat

EDTA

Heparine

F- inhibeert de enzymatische activiteit

Complexatie Ca2+

Prothrombinethrombine

slide6

Bepaling van…

  • een targetcomponent

creatinine, bilirubine, ureum, cholesterol...

  • een enzymactiviteit

Alkalische fosfatase, LDH, …

slide7

Bepaling van een targetcomponent

  • Algemene strategie
  • Monster:ontdooien
  •  mengen !
  • Deproteïniseren:= hogere structuren van proteïnen

H2SO4, TCA, EtOH

  • Centrifugeren
slide8

Supernatans: = bovenstaande vloeistof

moet steeds HELDER zijn!

SpectrofotometrieFluorimetrie

- na chemische kleurreactie

bilirubine, glucose colorimetrisch Phenylalanine

- na enzymatische omzetting

  • glucose enzymatisch
slide9

Bepaling van eenenzymactiviteit

  •  bepaling van targetcomponent
  • uitvoering op speciale spectrofotometers
  • rekening houden metchemische structuur
  • Michaëlis-Menten !!!!
  • meestal kinetische bepaling

- overmaat substraat toevoegen

- hoev. substraat afgebroken/ tijdseenheid

of hoev. product gevormd/ tijdseenheid

 spectrofotometrisch volgen

- enzymactiviteit berekenen

slide10

Reactie-

snelheid

0de orde:overmaat substraat

bepalen van enzymactiviteit

Conc. Substraat

1ste orde:overmaat enzyme

bepalen van substraat (targetcomponent)

slide11

Algemene Richtlijnen

Stalen

!! steeds HOMOGENISEREN: omzwenken

niet schudden

  • 1 plasmastaal ( 9 mL)
      • gedurende volledig practicum bewaren
      • onmiddellijk na gebruik in de ijskast
      • niet in de zon laten staan
      • zilverpapier rond staal: zelf meebrengen (bilirubine breektaf o.i.v. licht)
slide12

1 bloedstaalhematologie

STEEDS op de dag zelf ter beschikking gesteld

Opmerking: Handschoenen!

slide13

Materiaal

  • Plastiek box
      • materiaal
      • lijst controleren bij begin practicum
  • Chronometers
  • KnikkersZelf meebrengen
  • Zilverpapier
  • Spectrofotometers
      • steeds aangeduid toestel gebruiken
      • ALLEEN plastieken cuvetten gebruiken
      • cuvetten voorspoelen
slide14

Centrifuges

    • STEEDSsymmetrisch vullen

Indien nodig: evenwicht door toevoegen van een buis water

    • STEEDScentrifugeerbuizen merken!



 = 

 = 

slide15

Reagentia

  • Standaarden:
    • meestal 1 per groep
    • correcte concentratie gebruiken in de berekening
    • nooit voorspoelen met standaardoplossingen
    • contaminatie vermijden!
    • ijskast!
  • Producten aan weegschaal:
    • droog houden: deksels op potten!!
  • Vloeibare reagentia:
    • flessen afsluiten met juiste stoppen  contaminatie!
  • Kits: zuinig zijn!! (LDH en glucose enzymatisch slechts 1x uitvoeren)
slide16

Verslagen

  • Geen papieren verslagen meer
  • Resultaten in SI-units (zie omrekeningstabel, bijlage 2)
  • Resultaten in computer ingeven, LOGIN en PASWOORD worden samen met staal geleverd.
slide17

Algemeen - Milieu - Veiligheid

  • Proper werken - ‘s Avonds opruimen (trekkasten, microscopen!)
  • GEEN jassen, GEEN boekentassen
  • LABOJAS verplicht
  • VEILIGHEIDSBRIL
  • NIET met de mond pipetteren (peer)
  • MILIEU!!! GEEN reagentia in wasbakken (ook niet vanuit cuvetten), enkel in afvalvaten
slide18

Voorbereiding:

  • Dagelijks ondervraging mogelijk
  • Zowel schriftelijk als mondeling
  • Geen examenproef, dus GOED WERKEN
  • Resultaat practicum telt voor 25% mee in het eindresultaat van het opleidingsonderdeel Medische Biochemie !!!!
slide19

Technieken

  • Spectrofotometrie
slide20

Spectrofotometrie

Lichtstraal van bepaalde energie ( E 1/ ) die door een oplossing wordt gestuurd zal met de moleculen van die oplossing interactie vertonen.

De buitenste electronen van de moleculen worden door de EMS naar een hogere energietoestand gebracht.

Intensiteit lichtstraal daalt.

dI

I0

Intensiteit

I

Afstand

slide21

- dI  I0met

      •  N*
  • via mathematische afleiding:Wet van Lambert-Beer
  • I0
      • E = log = . M . l
  • I
  • E = extinctie
  •  = molaire extinctiecoëfficiënt
  • M = molariteit v/d oplossing
  • l = weglengte
  • I0 = oorspronkelijke intensiteit
  • N* = # absorberende deeltjes / cm2 doorsnede
slide22

I

detector

  • Spectrofotometer: schematisch
      • - onderdelen 1. lichtbron (UV, of zichtbaar)
      • 2. golflengteselector
      • 3. cuvet (glas,plastiek of quartz)
      • 4. intensiteitsmeter (fotogevoelige cel)
      • - meestal 2 schaaluitdrukkingen: T en E
      • E = log 1 / T

I0

1 2 3 4

slide23

Doel = Concentratiemetingen

      • 1. met 1 bekende en een onbekende: 1-puntscalibratie
  • Ex Cx Ex Cx
  • = Est Cst Est Cst
      • 2. met reeks bekenden en onbekende: ijklijn

Ex . Cst

Est

Cx =

E4

E3

E2

E1

y = ax + b

Ex

C1 C2 C3 C4

Cx

slide24

Proeven

  • Medische achtergrond
  • Praktische aspecten
hematologie
HEMATOLOGIE
  • RBC of erythrocyten:
    • Aantal
  • WBC of leucocyten:
    • Aantal
    • Leucocytaire formule
slide26

Fysiologisch: bewoners hooggebergte of hoogtestage

 O2-gebrek  EPO 

Pathologisch: t.g.v. beenmerg- of niertumor

Overmatig bloedverlies

Hemolytische anemie

Defecte bloedaanmaak

RBC

Anemie

Polycythemie

# RBC en/of Hb 

# RBC en/of Hb 

slide27
WBC
  • Onmisbare rol in het afweermechanisme
  • Pathologie:

LeucopenieLeucocytose

# WBC < 4000 # WBC > 10000

Differentiatie  leucocytaire formule

Vb. # granulocyten < 1000/ µL  infectiegevaar 

praktisch
Praktisch
  • VOLBLOED: de dag zelf ter beschikking
  • Tellen RBC:
    • Telkamer van Bürker: 2 kamers per draagglas
    • Hayemopl.: bevat HgCl2 (GIFTIG)
  • Leucocytaire formule:
    • Geen dekglaasje, maar een dr. immersie-olie
  • Microscopen:
    • Lenzen ev. schoonmaken met xylol
    • Voorwerpglaasje NIET raken met lens
ureum

Ureum- of ornithinecyclus

Omzetting NH4+-ionen tot ureum in lever

Minder toxisch

Gemakkelijke eliminatie langs nier

  • N-bevattende eindprodukten  urine
  • Uremie nierfunctie testen
UREUM
  • Degradatie van ANZ  afsplitsing a-NH2-groep

trans- of de-aminatie-reactie

  • Elk metaboliserend weefsel produceert NH4+  toxisch
praktisch30
Praktisch
  • Proefbuizen afsluiten met knikker bediende
  • TIMING!!!
bilirubine
BILIRUBINE
  • Hb (MW: 64450):
    • Tetrameer = 4 HEEM groepen + 4 GLOBINE ketens
    • Drager van O2
  • Biodegradatie Hb (lever):
    • Splitsing in heem en globine
    • Proteïnedeel  proteïne-catabolisme
    • Heem bilirubine  glucuronidatie (gal)  darm: faeces

urine

slide32

Geelzucht of icterus

Hyperbilirubinemie: opstapeling bilirubine t.g.v.

levercelbeschadiging

obstructie van de galafvoer

  • Bilirubine: lichtgevoelig zilverpapier
  • Enkel totaal bilirubine wordt bepaald
  • Diazo II en diazoreagens: zelf maken
  • Ijklijn: zie p. 37

Praktisch

creatinine
CREATININE
  • Creatine: glycine + arginine + methionine

belangrijke spierconstituent

  • Fosfocreatine: ° spieren in rust

ogenblikkelijke E-leverancier voor spiercontracties

cycliseert spontaan tot creatinine

  • Creatinine: nutteloos afvalprodukt

uitscheiding door nier

  • Creatininemie o.a.nierinsufficiëntie
praktisch34
Praktisch
  • Creatinine stockstandaard :  frigo

 nog verdunnen

  • MIN. 1u incuberen
  • Alk. picraatreagens vlak voor gebruik bereiden
  • Natriumtungstaat = natriumwolframaat
elektroforese
ELEKTROFORESE
  • %-samenstelling van de EW
    • Albumine
    • Diverse globulines (o.a.  -globulines immunologische reflex)

afwijking: indicatie pathologie

  • Scheiding: gebaseerd op differentiële migratie van geladen EW in een elektrisch veld (zie ook item in Webcourse)

Praktisch

  • Let op: elektroforesekamer in werking 220V

reagens om strips op te lossen is sterk zuur  peer

glucose
GLUCOSE
  • Deonmiddellijke E-bronbij uitstek voor de cellen
      • bij overmaat: start glucose consumptie

glycogenese, glycolyse, lipogenese

      • bij tekort: start glucose productie

gycogenolyse, gluconeogenese, interconversie

      • dirigenten: insuline + glucagon
  • Diabetes Mellitus of suikerziekte:
      • basisdefect: insuline
      • biochemisch: hyperglycemie

glycosurie

ketogenese en acidose

      •  klinische symptomen
slide37

Bepalingen

  • Hexokinasemethode: meest specifieke methode

glucose enzymatisch

hexokinase

glucose glucose-6-P

ATP ADP

G-6-fofaat-DH

glucose-6-P + NADP+ 6-fosfogluconaat + NADPH + H+

NADPH  spectrofotometrisch van NADP+

* Slechts 1 X per student

* TIMING

* [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

slide38
Colorimetrische methode: Somogyi-Nelson

glucose colorimetrisch

      •  van eiwitten
      • kleurvorming gebaseerd op reducerende eigenschappen

* arsenomolybdaat-reagens: giftig, gebruik dispenser

* [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

slide39

ENZYMACTIVITEITSBEPALINGEN

  • Frequent uitgevoerd in het klinisch labo
  • Soorten plasma-enzymen:
    • Plasma-specifieke
    • Niet-specifieke = enzymen van cellulair metabolisme

conc plasma > conc cellen

specifieke functie

aanmaak in lever

conc plasma  bij leverdeficiëntie

specifieke voor weefsel of orgaan

conc plasma bij celbeschadeging

vb. ADH in levercellen

alkalische fosfatase alp
Alkalische fosfatase (ALP)
  • Opsporing van o.a. lever- en botafwijkingen
  • p-nitrophenylfosfaat p-nitrophenol
  • Absorbtie van p-nitrophenol bij 405 nm
  • WWB 30°C
  • Opletten: bij 37° C denatureert ALP!

Praktisch

Niet te lang!

ad