Download
slide1 n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie PowerPoint Presentation
Download Presentation
Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie

Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie

441 Views Download Presentation
Download Presentation

Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Praktische Oefeningen • MEDISCHE BIOCHEMIE • Prof. Dr. J. Van Bocxlaer • Apr. Ruben t’ Kindt • Apr. Michael Storme • Apr. Julie De Smet • Mr. Wim Goeteyn • Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse

  2. Overzicht • Doel • Algemene richtlijnen • Technieken • Uit te voeren proeven

  3. Doel • = bepaling van endogene componenten in een • biologische matrix... • Bloed Urine Punctievocht Etc. • Serum / Plasma • Complicatie:vele andere, gelijkaardige componenten aanwezig dikwijls in veel  conc. •  nood aanSELECTIVITEIT • SENSITIVITEIT • …om pathologische toestandenop te sporen en/of te bevestigen

  4. Afname zonder • anticoagulans • STOLLING • Afname met • anticoagulans • GEEN STOLLING uitzakking of centrifugatie SERUM: helder supernatans PLASMA Prop: cellulair materiaal stollingsEW RBC, WBC • Bloed

  5. Anticoagulans • = antistollingsmiddel • wordt toegevoegd aan proefbuis voor bloedafname Voorbeelden: NaF NaCitraat EDTA Heparine F- inhibeert de enzymatische activiteit Complexatie Ca2+ Prothrombinethrombine

  6. Bepaling van… • een targetcomponent creatinine, bilirubine, ureum, cholesterol... • een enzymactiviteit Alkalische fosfatase, LDH, …

  7. Bepaling van een targetcomponent • Algemene strategie • Monster:ontdooien •  mengen ! • Deproteïniseren:= hogere structuren van proteïnen H2SO4, TCA, EtOH • Centrifugeren

  8. Supernatans: = bovenstaande vloeistof moet steeds HELDER zijn! SpectrofotometrieFluorimetrie - na chemische kleurreactie bilirubine, glucose colorimetrisch Phenylalanine - na enzymatische omzetting • glucose enzymatisch

  9. Bepaling van eenenzymactiviteit •  bepaling van targetcomponent • uitvoering op speciale spectrofotometers • rekening houden metchemische structuur • Michaëlis-Menten !!!! • meestal kinetische bepaling - overmaat substraat toevoegen - hoev. substraat afgebroken/ tijdseenheid of hoev. product gevormd/ tijdseenheid  spectrofotometrisch volgen - enzymactiviteit berekenen

  10. Reactie- snelheid 0de orde:overmaat substraat bepalen van enzymactiviteit Conc. Substraat 1ste orde:overmaat enzyme bepalen van substraat (targetcomponent)

  11. Algemene Richtlijnen Stalen !! steeds HOMOGENISEREN: omzwenken niet schudden • 1 plasmastaal ( 9 mL) • gedurende volledig practicum bewaren • onmiddellijk na gebruik in de ijskast • niet in de zon laten staan • zilverpapier rond staal: zelf meebrengen (bilirubine breektaf o.i.v. licht)

  12. 1 bloedstaalhematologie STEEDS op de dag zelf ter beschikking gesteld Opmerking: Handschoenen!

  13. Materiaal • Plastiek box • materiaal • lijst controleren bij begin practicum • Chronometers • KnikkersZelf meebrengen • Zilverpapier • Spectrofotometers • steeds aangeduid toestel gebruiken • ALLEEN plastieken cuvetten gebruiken • cuvetten voorspoelen

  14. Centrifuges • STEEDSsymmetrisch vullen Indien nodig: evenwicht door toevoegen van een buis water • STEEDScentrifugeerbuizen merken!     =   = 

  15. Reagentia • Standaarden: • meestal 1 per groep • correcte concentratie gebruiken in de berekening • nooit voorspoelen met standaardoplossingen • contaminatie vermijden! • ijskast! • Producten aan weegschaal: • droog houden: deksels op potten!! • Vloeibare reagentia: • flessen afsluiten met juiste stoppen  contaminatie! • Kits: zuinig zijn!! (LDH en glucose enzymatisch slechts 1x uitvoeren)

  16. Verslagen • Geen papieren verslagen meer • Resultaten in SI-units (zie omrekeningstabel, bijlage 2) • Resultaten in computer ingeven, LOGIN en PASWOORD worden samen met staal geleverd.

  17. Algemeen - Milieu - Veiligheid • Proper werken - ‘s Avonds opruimen (trekkasten, microscopen!) • GEEN jassen, GEEN boekentassen • LABOJAS verplicht • VEILIGHEIDSBRIL • NIET met de mond pipetteren (peer) • MILIEU!!! GEEN reagentia in wasbakken (ook niet vanuit cuvetten), enkel in afvalvaten

  18. Voorbereiding: • Dagelijks ondervraging mogelijk • Zowel schriftelijk als mondeling • Geen examenproef, dus GOED WERKEN • Resultaat practicum telt voor 25% mee in het eindresultaat van het opleidingsonderdeel Medische Biochemie !!!!

  19. Technieken • Spectrofotometrie

  20. Spectrofotometrie Lichtstraal van bepaalde energie ( E 1/ ) die door een oplossing wordt gestuurd zal met de moleculen van die oplossing interactie vertonen. De buitenste electronen van de moleculen worden door de EMS naar een hogere energietoestand gebracht. Intensiteit lichtstraal daalt. dI I0 Intensiteit I Afstand

  21. - dI  I0met •  N* • via mathematische afleiding:Wet van Lambert-Beer • I0 • E = log = . M . l • I • E = extinctie •  = molaire extinctiecoëfficiënt • M = molariteit v/d oplossing • l = weglengte • I0 = oorspronkelijke intensiteit • N* = # absorberende deeltjes / cm2 doorsnede

  22. I detector • Spectrofotometer: schematisch • - onderdelen 1. lichtbron (UV, of zichtbaar) • 2. golflengteselector • 3. cuvet (glas,plastiek of quartz) • 4. intensiteitsmeter (fotogevoelige cel) • - meestal 2 schaaluitdrukkingen: T en E • E = log 1 / T I0 1 2 3 4

  23. Doel = Concentratiemetingen • 1. met 1 bekende en een onbekende: 1-puntscalibratie • Ex Cx Ex Cx • = Est Cst Est Cst • 2. met reeks bekenden en onbekende: ijklijn Ex . Cst Est   Cx = E4 E3 E2 E1 y = ax + b Ex C1 C2 C3 C4 Cx

  24. Proeven • Medische achtergrond • Praktische aspecten

  25. HEMATOLOGIE • RBC of erythrocyten: • Aantal • WBC of leucocyten: • Aantal • Leucocytaire formule

  26. Fysiologisch: bewoners hooggebergte of hoogtestage  O2-gebrek  EPO  Pathologisch: t.g.v. beenmerg- of niertumor Overmatig bloedverlies Hemolytische anemie Defecte bloedaanmaak RBC Anemie Polycythemie # RBC en/of Hb  # RBC en/of Hb 

  27. WBC • Onmisbare rol in het afweermechanisme • Pathologie: LeucopenieLeucocytose # WBC < 4000 # WBC > 10000 Differentiatie  leucocytaire formule Vb. # granulocyten < 1000/ µL  infectiegevaar 

  28. Praktisch • VOLBLOED: de dag zelf ter beschikking • Tellen RBC: • Telkamer van Bürker: 2 kamers per draagglas • Hayemopl.: bevat HgCl2 (GIFTIG) • Leucocytaire formule: • Geen dekglaasje, maar een dr. immersie-olie • Microscopen: • Lenzen ev. schoonmaken met xylol • Voorwerpglaasje NIET raken met lens

  29. Ureum- of ornithinecyclus Omzetting NH4+-ionen tot ureum in lever Minder toxisch Gemakkelijke eliminatie langs nier • N-bevattende eindprodukten  urine • Uremie nierfunctie testen UREUM • Degradatie van ANZ  afsplitsing a-NH2-groep trans- of de-aminatie-reactie • Elk metaboliserend weefsel produceert NH4+  toxisch

  30. Praktisch • Proefbuizen afsluiten met knikker bediende • TIMING!!!

  31. BILIRUBINE • Hb (MW: 64450): • Tetrameer = 4 HEEM groepen + 4 GLOBINE ketens • Drager van O2 • Biodegradatie Hb (lever): • Splitsing in heem en globine • Proteïnedeel  proteïne-catabolisme • Heem bilirubine  glucuronidatie (gal)  darm: faeces urine

  32. Geelzucht of icterus Hyperbilirubinemie: opstapeling bilirubine t.g.v. levercelbeschadiging obstructie van de galafvoer • Bilirubine: lichtgevoelig zilverpapier • Enkel totaal bilirubine wordt bepaald • Diazo II en diazoreagens: zelf maken • Ijklijn: zie p. 37 Praktisch

  33. CREATININE • Creatine: glycine + arginine + methionine belangrijke spierconstituent • Fosfocreatine: ° spieren in rust ogenblikkelijke E-leverancier voor spiercontracties cycliseert spontaan tot creatinine • Creatinine: nutteloos afvalprodukt uitscheiding door nier • Creatininemie o.a.nierinsufficiëntie

  34. Praktisch • Creatinine stockstandaard :  frigo  nog verdunnen • MIN. 1u incuberen • Alk. picraatreagens vlak voor gebruik bereiden • Natriumtungstaat = natriumwolframaat

  35. ELEKTROFORESE • %-samenstelling van de EW • Albumine • Diverse globulines (o.a.  -globulines immunologische reflex) afwijking: indicatie pathologie • Scheiding: gebaseerd op differentiële migratie van geladen EW in een elektrisch veld (zie ook item in Webcourse) Praktisch • Let op: elektroforesekamer in werking 220V reagens om strips op te lossen is sterk zuur  peer

  36. GLUCOSE • Deonmiddellijke E-bronbij uitstek voor de cellen • bij overmaat: start glucose consumptie glycogenese, glycolyse, lipogenese • bij tekort: start glucose productie gycogenolyse, gluconeogenese, interconversie • dirigenten: insuline + glucagon • Diabetes Mellitus of suikerziekte: • basisdefect: insuline • biochemisch: hyperglycemie glycosurie ketogenese en acidose •  klinische symptomen

  37. Bepalingen • Hexokinasemethode: meest specifieke methode glucose enzymatisch hexokinase glucose glucose-6-P ATP ADP G-6-fofaat-DH glucose-6-P + NADP+ 6-fosfogluconaat + NADPH + H+ NADPH  spectrofotometrisch van NADP+ * Slechts 1 X per student * TIMING * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

  38. Colorimetrische methode: Somogyi-Nelson glucose colorimetrisch •  van eiwitten • kleurvorming gebaseerd op reducerende eigenschappen * arsenomolybdaat-reagens: giftig, gebruik dispenser * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

  39. ENZYMACTIVITEITSBEPALINGEN • Frequent uitgevoerd in het klinisch labo • Soorten plasma-enzymen: • Plasma-specifieke • Niet-specifieke = enzymen van cellulair metabolisme conc plasma > conc cellen specifieke functie aanmaak in lever conc plasma  bij leverdeficiëntie specifieke voor weefsel of orgaan conc plasma bij celbeschadeging vb. ADH in levercellen

  40. Alkalische fosfatase (ALP) • Opsporing van o.a. lever- en botafwijkingen • p-nitrophenylfosfaat p-nitrophenol • Absorbtie van p-nitrophenol bij 405 nm • WWB 30°C • Opletten: bij 37° C denatureert ALP! Praktisch Niet te lang!